棉花和玉米對機械損傷誘導的棉花及其鄰近酶活性的影響

0田間植物間的通訊昆蟲飼料不僅能誘導植物本身的抗逆反應，還能誘導附近健康植物的抗逆反應，即植物間的溝通效應。植物通訊首先是由Rhoades在1983年提出來的,他發現被毛蟲取食的樹有很少的毛蟲再來取食,令人驚訝的是鄰近健康的樹也有很少的毛蟲取食。他提出受害植物和鄰近植物間空氣中的交流能引起鄰近植物抗性水平的增加。后來很多的實驗結果支持植物間交流的存在。嚴格控制實驗室條件的結果可以表明植物間是通過空氣進行交流的。番茄植物與剪枝的山艾一起放在小的密閉容器內可以增加番茄蛋白酶抑制劑的含量,蛋白酶抑制劑可以減少昆蟲的取食。其他的密閉容器中的實驗支持并且擴展了這個結論。目前在田間植物間的通訊至少在2個系統中得到證實,野生煙草和歐洲榿木。Karban的田間試驗證明了田間存在山艾和煙草的通訊。除了受害的山艾,其鄰近植株的抗性也會增加。Karban等研究發現田間植物間的距離大于60cm,同時有植物間空氣流通的條件,鄰近植株的抗性也會增加。當阻止空氣流通后,包括樹枝間和植物間的系統誘導抗性都不能檢測到。研究發現與老山艾相比,田間幼嫩山艾是更有效的植物內和植物間的交流者。因此這個通訊是通過空氣中信號介導的,而且減少了近距離生長于受害的山艾樹的煙草植物的傷害。Tscharntke等的田間試驗表明楊毛臀螢葉甲(Agelasticaalni)避免取食鄰近人工損傷的榿木植物的葉片。楊毛臀螢葉甲取食榿木誘導釋放乙烯和一系列揮發性化合物,激活茉莉酸信號轉導途徑。受害榿木葉片酚類物質含量增加,多酚氧化酶、脂氧合酶和過氧化物酶的活性增加,蛋白酶抑制劑也增加。棉花和玉米是中國重要的經濟作物和糧食作物,棉蚜和玉米螟也是棉花和玉米上主要害蟲。目前還沒有關于棉花和玉米間通訊作用的研究報道。為了明確昆蟲取食誘導棉花和玉米間的通訊機制,測定了不同處理包括棉蚜取食和機械損傷誘導棉花及其鄰近玉米,以及玉米螟取食和機械損傷誘導玉米及其鄰近棉花的多酚氧化酶和過氧化物酶的活性。研究昆蟲取食和機械損傷誘導棉花和玉米間的通訊作用為作物間作套種及棉蚜和玉米螟的綜合防治提供了理論依據。1材料和方法1.1液配方對znso4,5.8.7mo4的影響‘中棉35’,種子浸泡催芽后,種于無菌的沙土中(溫度26~30℃,相對濕度50%~60%),待2片子葉展開后,轉移到裝有營養液的塑料杯中,在溫室培養1~2周供試。營養液配方為0.75mmol/LK2SO4,0.25mmol/LKH2PO4,0.1mmol/LKCl,0.65mmol/LMgSO4,2mmol/LCa(NO4)2,0.1mmol/LFe-NaEDTA,1×10-2mmol/LH3BO3,1×10-3mmol/LMgSO4,1×10-3mmol/LZnSO4,4×10-4mmol/LCuSO4,5×10-6mmol/L(NH4)6MoO4。玉米是‘農大108’,浸泡12h后種于營養土中,2周后用于實驗。1.2玉米螟的養殖棉蚜,本實驗室人工飼養多代的棉蚜品系,飼養溫度為25~35℃,相對濕度為60%~80%,日光溫室為自然光周期。玉米螟,卵購于中國農業科學院植物保護所王振營課題組。然后室內飼養,用人工飼料飼養至3齡。飼養溫度為25~28℃,相對濕度是60%~80%,光周期為16h:8h。1.3棉苗、玉米對玉米的選擇選用長勢一致的棉苗和玉米,在3個容積為5L的干燥器內,設對照棉苗和對照接收玉米、機械損傷(葉片針刺50孔,直徑2mm)和機械損傷接收玉米,蚜蟲取食(每株100頭)棉苗和取食接收玉米共3組6個處理,每組重復3次,每個處理2次重復,每次重復2株棉苗、2株玉米。測定48h各處理棉花和玉米多酚氧化酶和過氧化物酶的活性。在另3個容積為5L的干燥器內,設對照玉米和對照接收棉苗、機械損傷(葉片針刺每株50孔,直徑1~2mm)玉米和機械損傷接受棉苗,玉米螟取食(每株6頭)玉米和接受棉苗共3組6個處理,每組重復3次,每個處理2個重復,每個重復玉米和棉苗各2株。測定48h各處理棉花和玉米多酚氧化酶和過氧化物酶的活性。1.4酶活性測定1.4.1ph值對活性的測定棉苗和玉米剪去根部后洗凈在液氮中研磨,每克苗加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮和4mL0.1mol/LpH7.0磷酸緩沖液(棉苗)或0.1mol/LpH6.5磷酸緩沖液(玉米),4℃,12000g離心20min,上清液用于活性測定。棉苗的反應體系為:反應緩沖液600μL,底物0.1mol/L鄰苯二酚400μL,150μL酶液;玉米的反應體系為:反應緩沖液1000μL,100μL底物0.1mol/L鄰苯二酚,100μL酶液。于420nm波長處,用時間驅動程序自動監測2min內的變化,并記錄反應速度(OD420/min)。以每分鐘在420nm增加0.01為一個活力單位。1.4.2酸緩沖液和玉米的活性測定棉苗和玉米剪去根部后洗凈在液氮中研磨,每g苗加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮和4mL上0.1mol/LpH7.0磷酸緩沖液(棉苗)或0.1mol/LpH6.5磷酸緩沖液(玉米),4℃,12000g離心20min,上清液用于活性測定。棉苗的反應體系為:1345μLpH7.5緩沖液,20μL50mmol/L愈創木酚,20μL50mmol/L雙氧水,25μL酶液。玉米的反應體系為:1270μLpH7.5緩沖液,20μL50mmol/L愈創木酚,20μL50mmol/L雙氧水,100μL酶液。于470nm波長處,用時間驅動程序自動監測2min內的變化,并記錄反應速度(OD470/min)。以每分鐘在470nm增加0.01為一個活力單位。1.5測定蛋白質含量參照Braford考馬斯亮蘭G-250方法。以標準牛血清白蛋白為標準蛋白制作標準曲線。2結果與分析2.1多酚氧化酶的活性變化2.1.1之間，多呈酸性pH對多酚氧化酶活性有很大的影響,植物多酚氧化酶的最適pH為4.5~8之間且大多呈酸性。所以本實驗測定了pH4.0~9.0范圍內棉花和玉米多酚氧化酶活性變化,結果如圖1和圖2所示,棉花幼苗組織中多酚氧化酶活性在pH5.0時活性最大。玉米多酚氧化酶的最適pH7.5。2.1.2棉/玉米中多酚氧化酶的活性如圖3和圖4所示,棉蚜取食和機械損傷誘導棉花多酚氧化酶的活性增加,處理48h,對照、機械損傷和蚜蟲取食誘導棉花多酚氧化酶的活性分別為0.18,0.20、0.29U/mg,棉蚜取食誘導棉花多酚氧化酶的活性是對照的1.61倍,與對照比差異顯著(P<0.05)。機械損傷和棉蚜取食誘導揮發物相應接收玉米的多酚氧化酶的活性與對照相比差異都不顯著(P<0.05)。機械損傷誘導揮發物接收玉米的多酚氧化酶的活性高于棉蚜取食誘導揮發物的接收組玉米的多酚氧化酶活性。2.2非典型酶活性變化2.2.1化物酶活性檢測如圖7和圖8所示,只有機械損傷誘導棉苗的過氧化物酶活性顯著增加(P<0.05),為對照的1.84倍。其余不同處理的棉苗和玉米的過氧化物酶活性都與對照差異不顯著(P<0.05)。2.2.2活性增加與對照試驗結果比較如圖9和圖10所示,機械損傷和玉米螟取食誘導玉米過氧化物酶的活性增加,與對照比差異顯著(P<0.05),分別是對照的3.56倍和4.79倍。而其相應的誘導揮發物接收棉苗的過氧化物酶活性都沒有增加,與對照比差異不顯著(P<0.05)。3棉專業患者對揮發性化合物的誘導昆蟲取食和機械損傷不僅誘導受害植物產生防御反應還能誘導鄰近健康植物的抗蟲性增加。雖然一些學者對植物間的這種通訊作用存在爭議。但是越來越多的研究證明了植物間通訊的存在。同種植物間的通訊典型的例子是利馬豆和黑榿木植物間的通訊。暴露于二斑葉螨取食誘導利馬豆釋放的揮發物中的健康利馬豆對捕食性螨的吸引力增加,葉螨的繁殖力下降。Tscharntke等田間和室內試驗都證明生長在葉甲取食黑榿木附近的黑榿木蛋白酶抑制劑PI活性增加,抗蟲性增加。異種植物間的通訊作用也有很多實驗證明。暴露于二斑葉螨取食利馬豆釋放的揮發性氣體中的黃瓜對捕食性滿的吸引力增強。Karban等的田間研究發現,受傷艾草灌叢附近的煙草多酚氧化酶活性升高,受蝗蟲和煙草天蛾的取食程度減小。秦秋菊等發現棉蚜取食和機械損傷不僅能誘導棉花的苯丙氨酸解氨酶和脂氧合酶活性增加,還能引起鄰近的健康棉花苯丙氨酸解氨酶和脂氧合酶活性增加。多酚氧化酶和過氧化物酶與植物防御反應相關。Constable等發現鱗翅目幼蟲取食能誘導多酚氧化酶的活性。Constabel等還發現機械損傷和昆蟲取食都能誘導PPO活性增加,不僅受害葉片的多酚氧化酶活性增加而且同一植株上未受害的部分多酚氧化酶活力也被誘導。Duffey等發現粉虱(Bemisiaargentigolii)取食番茄誘導過氧化物酶的活性增加。本試驗的結果表明:棉蚜取食和機械損傷誘導棉花的多酚氧化酶和過氧化物酶的活性均有不同程度的增加;玉米螟取食和機械損傷誘導玉米的多酚氧化酶和過氧化物酶活性比對照高,并且玉米螟取食和機械損傷誘導玉米的過氧化物酶的活性與對照比差異顯著(P<0.05)。這與Constabel和Duffey等的結論一致的。而暴露于棉蚜取食和機械損傷誘導揮發物中的玉米多酚氧化酶和過氧化物酶的活性并沒有增加;暴露于玉米螟取食和機械損傷誘導釋放的揮發性化合物中的棉苗多酚氧化酶和過氧化物酶的活性也沒有增加,與對照比差異都不顯著(P<