3種方法提取艾納香葉揮發性成分的gc-ms分析

愛納香（l.）d.是貴州羅甸縣的一種地下藥物。艾納香葉和嫩枝可制取艾片(左旋龍腦)和艾納香揮發油。艾納香揮發油有獨特香氣,具有抗菌、消炎、消腫、止痛等作用,受到醫療美容和香精香料行業的親睞。揮發油的傳統提取方法為水蒸汽蒸餾法,郝小燕等,周欣等,杜萍等,Bhuiyan等都使用水蒸汽蒸餾法(steamdistillation,SD)制取艾納香揮發油,并研究其組成,但是水蒸汽蒸餾耗時長,餾出水量大,萃取時消耗溶劑量大,操作繁瑣。近幾十年多種揮發油提取方法得到發展,同時蒸餾萃取法(simultaneousdistillationextraction,SDE)是水蒸汽蒸餾與溶劑萃取二合為一,用于提取揮發油可減少操作步驟,節省萃取溶劑,設備相對簡單。頂空固相微萃取(headspacesolid-phasemicroextraction,HS-SPME)是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的無溶劑樣品預處理技術,具有處理時間短、不使用有機溶劑、真實反映樣品中揮發性物質組成等優點,適用于艾納香葉揮發性物質組成分析。本研究利用氣質聯用(GC-MS)技術分析SD和SDE提取的艾納香葉油狀揮發物,并分析HS-SPME提取的艾納香葉揮發性物質組成,對三者的化學成分進行對比,為選擇合適的艾納香葉油狀揮發物的提取方法提供參考。1材料和方法1.1gc/ms-ms氣相色譜質譜條件艾納香葉貴州艾源生態藥業開發有限公司(樣品采摘時間為2010年11月,產地貴州省羅甸縣);所用試劑均為分析純。Varian1200LGC/MS-MS氣相色譜質譜聯用儀美國Varian公司;DB-5彈性石英毛細管柱30m×0.25mm,0.25μm,美國Agilent公司;Supleco固相微萃取裝置、75μmCAR/PDMS萃取頭美國Supelco公司。1.2實驗方法1.2.1揮發油的提取稱取艾納香葉粉碎物(60~80目)50.00g置于2000mL圓底燒瓶中,加入1000mL去離子水,電熱套加熱蒸餾,蒸餾過程中持續加入去離子水以補充餾出水,餾出液達到5000mL時停止蒸餾(耗時約10h),合并餾出液,用等體積石油醚(30~60℃)萃取1h,分液,加入無水硫酸鈉干燥,以上操作重復3次(共使用原料約150g)。合并石油醚,水浴加熱50℃回收石油醚,最終獲得黃色揮發物4.4907g,得率為2.99%。將黃色揮發物與石油醚(30~60℃)按1∶5(g∶mL)配制成溶液,4℃存放24h進行重結晶,分出晶體,剩余物揮干石油醚,得到黃色油狀揮發物質量1.4132g,得率為0.94%,用于GC-MS分析。以上實驗平行3次。1.2.2揮發油的提取稱取艾納香葉粉碎物(60~80目)50.00g置于2000mL圓底燒瓶中,加入1000mL去離子水,電熱套加熱(與1.2.1項保持相同加熱強度);在另一500mL燒瓶中加入200mL石油醚(30~60℃),水浴加熱50℃,同時蒸餾萃取10h,取下石油醚相燒瓶,加無水硫酸鈉干燥,以上操作重復3次(共使用原料約150g)。合并石油醚,水浴加熱50℃回收石油醚,最終獲得黃色揮發物4.62g,得率為3.08%。將黃色揮發物與石油醚(30~60℃)按1∶5(g∶mL)配制成溶液,4℃存放24h進行重結晶,分出晶體,剩余物揮干石油醚,得到黃色油狀揮發物質量1.9067g,得率為1.27%,用于GC-MS分析。以上實驗平行3次。1.2.3頂空固相萃取稱取艾納香葉5g置于樣品瓶中,用聚四氟乙烯隔墊密封,使用CAR/PDMS萃取頭進行萃取,環境溫度45℃條件下頂空吸附30min。以上實驗平行3次。1.3儀器條件1.3.1條件11.3.2傳感器電路電子轟擊離子源(EI),離子源溫度200℃,電子能量70eV,發射電流34.6(A,檢測器電壓1000V,接口溫度280℃,掃描質量范圍35~500amu。1.3.3反匹配度分析采集到的質譜圖同時與NIST和Wiley標準譜庫對照,對組分定性,僅報道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鑒定結果。用峰面積歸一法計算各化學成分的相對含量。2結果與分析2.1gc-ms分析采用SD和SDE提取艾納香葉油狀揮發物,并用HS-SPME提取艾納香葉揮發性物質,聯合GC-MS技術對3個提取物樣品進行分析,初步定性組分70種,其中有50種屬于萜類化合物,萜烯種類最多,共30種,其他依次為萜醇16種、萜酮2種、萜醛1種、萜酯1種。圖1為3個樣品的GC-MS總離子圖。通過譜庫檢索和分析,檢出3個樣品的成分組成見表1。3個樣品的相對含量前5位的組分中,l-龍腦與樟腦香氣相似,具有類似松木的氣息,香氣清涼尖刺,微帶藥香、胡椒香;(E)-石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香,溫和的丁香香氣;花椒素具有濃郁的花椒香氣;桉葉醇具有桉樹特有的氣味和樟腦氣息,并有清涼的草藥味道;(+)-γ-古蕓烯具有古蕓香脂香氣;(E)-羅勒烯具有草香、花香并伴有橙花油氣息。從高相對含量組分的香氣特征發現,3個樣品的主體香氣相似,以清涼的樟腦香和花椒香氣為主,而油狀揮發物的氣味濃郁,這與作者的直觀嗅覺結果一致。2.2sd油狀揮發物相對組分含量分析SD提取油狀揮發物和HS-SPME提取揮發性物質共同含有組分35種,在兩樣品的組分中相對含量分別為89.28%和86.67%,其中萜類32種。共有醇類13種,相對含量分別為57.51%和21.09%,萜醇12種;酮類2種,樟腦屬萜酮;醚類1種,即百里氫醌二甲醚;酯類1種,即乙酸龍腦酯;烯類18種,全是萜烯,相對含量分別為19.06%和54.93%。以上數據表明,兩者共有組分種類占總種類數近70%,相對含量之和占各自總量近90%,可充分代表自身的香氣特征,兩者主體香氣特征相似。不同類別化合物在兩樣品中相對含量差異極大,主要表現在醇類、酮類和烯類物質,相對含量相差近3倍。SD油狀揮發物中醇類物質相對含量普遍高于HS-SPME揮發性物質中2倍以上,而HS-SPME揮發性組分中烯類物質相對含量普遍高于SD油狀揮發物中。從單一組分上看,SD油狀揮發物中l-龍腦、樟腦和HS-SPME揮發性物質中(+)-γ-古蕓烯、(E)-石竹烯的相對含量都超出對方近3倍,并且這幾種組分都是高含量組分。SD油狀揮發物獨有組分15種(萜類7種),相對含量為3.17%,其中醇類4種(0.78%),酮類2種(0.24%),醛類2種(0.3%),酯類1種(0.44%),烯類2種(0.24%),苯環類1種(0.66%)、烷烴類1種(0.26%)和酸類2種(0.25%);HS-SPME揮發性物質中獨有組分14種(萜類11種),相對含量為4.56%,其中醇類1種(0.28%),酮類2種(0.26%),烯類11種(4.02%)。以上數據表明,兩者各自獨有組分相對含量較低,除羅漢柏烯-13外都不足1%,SD油狀揮發物獨有組分主要是高沸點化合物,HS-SPME揮發性物質中獨有組分主要是烯類化合物,易被氧化。由于SD提取過程蒸餾溫度(100℃)遠高于HS-SPME提取過程溫度(45℃),因此低沸點、低含量、易氧化分解化合物不易保留,而高沸點化合物被收集得到。兩者獨有組分相對含量不高,對自身香氣影響不大,可認為SD油狀揮發物與HS-SPME提取的揮發性化合物組成相似。一般認為HS-SPME提取的揮發性化合物更接近原始樣品的香氣組成,因此可認為SD油狀揮發物代表艾納香原始香氣。經作者本人嗅聞認為油狀揮發物氣味較濃郁,可認為油狀揮發物濃縮了艾納香葉香氣成分。2.3油狀揮發物組分SDE油狀揮發物和HS-SPME揮發性物質共同含有組分18種,在SDE和HS-SPME提取組分中相對含量分別為88.21%和62.45%,其中萜類16種。共有醇類12種,相對含量分別為61.44%和20.78%,萜醇12種;酮類1種,即花椒素;醚類1種,即百里氫醌二甲醚;烯類4種,全是萜烯,相對含量分別為9.29%和31.81%。以上數據表明,兩者共有組分相對含量之和相差大,不同類別化合物在兩樣品中相對含量差異極大,主要表現在醇類、酮類和烯類物質,相對含量相差近3倍。SDE油狀揮發物中醇類物質相對含量普遍高于HS-SPME揮發性物質中近3倍,而HS-SPME揮發性物質中烯類物質相對含量普遍高于SDE油狀揮發物中近3倍。從單一組分上看,SDE油狀揮發物中l-龍腦、(-)-愈創木醇、10-表位-γ-桉葉醇、γ-桉葉醇、4,4-二甲基-四環[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]十三碳-9-醇、β-桉葉醇、綠花白千層醇和花椒素的相對含量超出HS-SPME揮發性物質中2倍以上;HS-SPME揮發性物質中(E)-石竹烯、α-石竹烯和別香橙烯的相對含量都超出SDE油狀揮發物中近5倍,兩者間差異較大。SDE油狀揮發物獨有組分6種(萜類1種),相對含量為4.5%,其中酮類1種(1.37%),醛類1種(0.51%),酯類3種(2.26%),烯類1種(0.36%);HS-SPME揮發性物質中獨有組分31種(萜類27種),相對含量為28.92%,其中醇類2種(0.59%),酮類3種(0.82%),酯類1種(0.36%),烯類25種(27.15%)。以上數據表明,兩者獨有組分相對含量差異巨大,SDE油狀揮發物獨有組分相對含量之和較小,主要是高沸點的酯類化合物,HS-SPME揮發性物質中獨有組分相對含量之和較大,主要是低含量烯類化合物。由于SDE過程中蒸餾和萃取溫度較SD過程還高,低沸點、低含量、易氧化、酯化化合物更不易保留,因此SDE油狀揮發物中酯類物質較多。兩者間共有組分與獨有組分的化合物種類和相對含量差異較大,SDE油狀揮發物并不能充分代表艾納香揮發性成分,但是經作者嗅聞認為差異并不明顯,只是油狀揮發物氣味較濃郁。2.4艾納香葉揮發性成分有普通成分,有6種兩油狀揮發物共同含有組分17種,在SD和SDE提取油狀揮發物中相對含量分別為79.38%和85.48%,其中萜類15種。共有醇類11種,相對含量分別為56.78%和58.71%,都屬萜醇;酮類1種,即花椒素;醚類1種,即百里氫醌二甲醚;烯類4種,全是萜烯,相對含量分別為12.53%和9.29%。以上數據表明,兩者共有組分幾乎涵蓋了各自相對含量超過1%的全部組分,相對含量之和占總量80%左右,足以代表自身的香氣特征。兩油狀揮發物的組分種數相差巨大,SD油狀揮發物組分總數比SDE多26個,SD油狀揮發物獨有組分33種(萜類23種),相對含量為13.7%,其中醇類6種(1.51%),酮類3種(2.68%),醛類2種(0.3%),酯類2種(0.64%),烯類16種(6.77%),苯環類1種(0.66%)、烷烴類1種(0.26%)和酸類2種(0.25%);SDE油狀揮發物獨有組分7種,相對含量為7.23%,其中醇類1種(2.73%),酮類1種(1.37%),醛類1種(0.51%),酯類3種(2.26%),烯類1種(0.36%)。SD油狀揮發物中獨有的醇類和烯類化合物達22種,大部分屬于低沸點或低含量化合物,SDE油狀揮發物中獨有組分都是高沸點化合物。此結果可能是因為SDE過程中萃取溫度(50℃)高于SD過程中萃取溫度(<20℃),經過長時間運行,低沸點和易氧化化合物難以保留。兩油狀揮發物共有組分相對含量之和接近,不同類別組分的相對含量差值不大,獨有組分種類差異大,但是相對含量低,因此可認為兩油狀揮發物的組分相似,經作者嗅聞認為兩者氣味相似。綜上所述,艾納香葉揮發性成分中主要為醇類和烯類物質,其中大部分都是萜類物質,樟腦香和花椒香為其主體香氣。SD油狀揮發物中所含組分比SDE油狀揮發物中豐富,保留較多低沸點、低含量化合物,與HS-SPME提取揮發性成分相比,又多收得高沸點化合物。SDE油狀揮發物組分種類少,含有高沸點化合物種類較多。由此認為,SD提取的油狀揮發物更接近原料揮發性成分組成,SDE提取的油狀揮發物組成與原料揮發性成分差異稍大,不適合提取低沸點化合物。而艾納香葉中低沸點化合物含量低,因此認為SD和SDE油狀揮發物組成差異不大。分析艾納香揮發性成分時,HS-SPME更能反映艾納香的香氣組成,但是對高沸點化合物提取效果不佳;SDE提取的組分少,但是對高沸點化合物提取效果好;SD提取的組分接近原料的揮發性成分組成,但是耗時長,耗溶劑多,操作繁瑣;綜合考慮,HS-SPME和SDE并用可達到滿意的分析效果。制取艾納香油狀揮發物時,HS-SPME不適用,只能用于檢測;SD雖提取組分豐富,但是消耗大,成本高;SDE雖提取組分少,但是基本代表原料的揮發性成分,經作者初步感官評價差異不明顯,而且此法用水和溶劑量都大大減少,過程簡化,設備簡單,成本降低,適合應用于大規模制取艾納香油狀揮發物。3艾納香葉揮發性成分組成利用SD和SDE提取艾納香葉油狀揮發物,并利用HS-SPME提取艾納香葉揮發性成分,再結合氣質聯用技術對其進行分析,初步定性出揮發性成分70種,以醇、烯類物質居多,且多為萜類物質。與HS-SPME提取揮發性成分相比,SD油狀揮發物保留艾納香葉揮發性組分較多,SDE油狀揮發物中低沸點化合物少,由于艾納香葉中低沸點化合物含量較低,所以兩油狀揮發物主要成分相似,其中相對含量最高的是l-龍腦。SDE與SD