飼料中添加硒酵母和維生素e對刺參生長、腎功能及抗病力的影響

杏仁是一種珍貴的產品，富含蛋白質、糖和養分，但不含膽固醇。它具有補充和增強的功能。其經濟價值可以稱為“人參”的樹冠。隨著自然資源的日益枯竭以及人們對刺參消費水平的不斷增加,我國在20世紀90年代末掀起了刺參人工養殖的熱潮。但隨著我國刺參大規模人工養殖的快速發展,細菌性與病毒性等疾病大面積發生,嚴重制約了該產業的持續健康發展,刺參疾病防御已成了當務之急。目前,通過提高水產動物免疫力來抵抗疾病的發生已經成為研究的熱點。由于免疫增強劑具有比抗菌素更安全,比疫苗作用范圍更廣等優點,越來越受到人們的重視,特別是對于提高以非特異性免疫為主的無脊椎動物的免疫力尤為重要。營養素不僅是水產動物生長發育所必需的物質基礎,而且在維持免疫系統的功能并使其免疫活性得到充分表達的過程中起到決定性的作用。主要的營養素類免疫增強劑包括氨基酸、維生素、微量元素等。維生素E是大多數水產動物必需的營養素之一,是一種重要的免疫增強劑,研究發現維生素E對水產動物免疫系統起著重要的作用。硒是水產動物正常生長和生理功能所必需的重要微量元素,在飼料中適量添加可以提高機體的免疫力與抗病力。硒酵母內有機硒的主要存在形式是硒代氨基酸,還有少部分硒與多糖或其他有機小分子結合。Wang等用含適量硒酵母的飼料飼喂斑點叉尾鮰后,魚體表現出明顯的生長優勢。華雪銘等在飼料中添加酵母硒后飼喂異育銀鯽,異育銀鯽對嗜水氣單胞菌的抵抗能力隨硒酵母添加量的增加而增大。王亭亭等在基礎飼料中添加花粉和酵母硒,飼喂中華鱉90d后,結果0.5×10-6酵母硒+0.1%花粉組能顯著促進中華鱉的生長。目前有關飼料中單獨添加硒酵母或維生素E以及二者合用對刺參或其他種類棘皮動物生長及免疫的影響尚未見報道。棘皮動物門屬后口動物,在無脊椎動物中進化地位很高,研究免疫增強劑對刺參生長、免疫力及抗病力等的影響具有重要的意義。本研究擬以刺參為研究對象,通過在刺參飼料中添加硒酵母和維生素E的組合,開展飼養試驗和注射致病細菌做攻毒試驗,以探討硒酵母和維生素E以及二者的交互作用對刺參生長、免疫力和抗病力的效果,為篩選刺參免疫增強劑配方和高效環保飼料的配制提供依據。1維生素e的來源1.1試驗材料硒酵母由湖北安琪酵母有限公司友情提供。維生素E由青島瑪斯特生物技術有限公司友情提供,有效含量為50%。飼料中維生素E(α-生育酚)的含量用高效液相色譜HPLC(HP110,USA)分析。1.2不同進口白魚粉的實測值試驗參照朱偉等的配方,以魚粉和豆粕為蛋白質源,魚油為脂肪源,配制成粗蛋白質含量為20.21%、粗脂肪含量為4.51%的基礎飼料(表1)。根據作者預試驗結果確定刺參飼料中維生素E的2個添加水平為0和250mg/kg,根據海水魚類中硒的需求量為0.2~0.5mg/kg及本試驗中硒酵母中硒的有效含量為1000mg/kg,確定本試驗中硒酵母的4個添加水平為0、100、300和600mg/kg。試驗共有8個處理,即在基礎飼料中分別添加0和250mg/kg維生素E,每一維生素E水平下分別添加0、100、300和600mg/kg硒酵母,共制成8種試驗飼料,分別用D1(對照組)、D2、D3、D4、D5、D6、D7和D8表示。其中,維生素E在8種試驗飼料中的實測值分別為22.6、23.4、23.8、22.5、269.2、267.8、270.6和266.8mg/kg。1)日本進口白魚粉:粗蛋白質含量為67.5%,粗脂肪含量為7.8%,均為干物質基礎。WhitefishmealimportedfromJapan:crudeproteincontentwas67.5%(DMbasis)andcrudelipidcontentwas7.8%(DMbasis).2)購于山東六合飼料有限公司PurchasedfromShandongLiuheGroupCo.,Ltd.,China。3)由青島瑪斯特生物技術有限公司友情提供KindlyprovidedbyQingdaoMasterBiotechnologyCo.,Ltd.,China。4)維生素預混料為每千克飼料提供Vitaminpremixprovidedthefollowingperkgofdiet:鹽酸硫胺素thiamin90mg,核黃素riboflavin150mg,鹽酸吡哆醇pyridoxinehydrochloride210mg,VB120.03mg,VK350mg,肌醇inositol600mg,泛酸鈣calciumpantothenate150mg,尼克酸niacinacid600mg,葉酸folicacid15mg,生物素biotin1.20mg,醋酸視黃醇retinolacetate32mg,VD312mg,VE120mg,乙氧基喹啉ethoxyqui150mg。5)礦物質預混料為每千克飼料提供Mineralpremixprovidedthefollowingperkgofdiet:KI0.8mg,CoCl2·6H2O(1%)40mg,CuSO4·5H2O100mg,FeSO4·7H2O450mg,ZnSO4·H2O250mg,MnSO4·H2O60mg,MgSO4·7H2O4000mg,Ca(H2PO4)2·H2O10600mg。1.3未投考慮參苗的投喂試驗用刺參購自青島市膠南聯合遠見生物技術有限公司,正式試驗前先在室內海水循環系統中暫養,期間飼喂基礎飼料。暫養結束后,隨機分為8組,每個處理設3個重復,每個重復25頭刺參[平均初始體重為(3.52±0.08)g]。參苗以重復為單位隨機分配到室內海水循環系統中的24只容積為50L的玻璃缸中。養殖試驗持續8周,初始投餌量為海參體重的3%~5%,根據每天各桶海參的攝食情況進行適當調整,每天投喂1次,投喂時間為17:00,次日08:00吸除殘餌和糞便。飼養期間連續充氣,水溫(17±1)℃,鹽度29~32,pH7.8~8.2,溶解氧不低于6.5mg/L。1.4cls活性的測定8周養殖試驗結束后,試驗參饑餓24h,然后對每個重復進行計數,稱重。分別從每個缸中隨機取5頭試驗參,取樣測定免疫指標,剩余試驗參用于攻毒試驗。1.4.1體腔液的采集及體腔細胞破碎上清液(CLS)的制備體腔液的采集參考Xing等的方法并做適當改進,將試驗參解剖取體腔液,吸取抗凝劑(0.05mol/LTris-HCl、0.03mol/LEDTA、3.1%NaCl,pH7.6)至抗凝劑與體腔液的體積比為1∶1,即得抗凝體腔液,一部分直接用于體腔細胞計數、吞噬活性以及呼吸爆發(RB)活性的測定;另一部分用于體腔CLS的制備,制備方法參考Wang等的方法并做適當改進,離心10min(5000r/min,4℃),棄去上清液,體腔細胞沉淀物用等體積冰凍的含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的PBS緩沖液重懸,體腔細胞懸液用超聲波(22kHz,0℃)破碎25s后,10000r/min離心10min(4℃),所得上清液即為CLS,吸取一部分CLS用于酚氧化酶(PO)活力的測定,另一部分放于-20℃冰箱中保存,用于其他指標的測定。1.4.2體腔細胞計數取50μL抗凝體腔液加入到150μL戊二醛固定液中,利用血球計數板在光學顯微鏡400倍下直接計數,計算出每毫升體腔液中體腔細胞數目。1.4.3吞噬活性的測定吞噬活性的測定參考Long等和王斌等的吞噬中性紅的方法,略有改動。取100μL抗凝體腔液加入96孔板中,貼壁30min后,棄上清液,加入100μL0.001mol/L的中性紅溶液,吞噬30min后,用生理鹽水洗掉未被吞噬的中性紅,加入100μL細胞裂解液(冰醋酸與無水乙醇體積比為1∶1),裂解20min后,在酶標儀(ModelMultiskanSpectrum,Thermo,USA)上測定溶液在波長540nm處的吸光值,以試驗條件下每106個體腔細胞對應的吸光值來表示吞噬活性。1.4.4RB活性的測定RB活性的測定參考Song等的方法,略有改動。在96微孔板中先加入50μL0.2%多聚賴氨酸(Sigma),然后加入100μL抗凝體腔液,離心10min(300r/min,4℃),去除上清液,加入100μL1μg/mL的佛波醇酯(PMA,Sigma),溫育30min(37℃),然后加入100μL0.3%四唑氮藍(NBT,Sigma),37℃條件下溫育30min,溫育結束后經離心10min(560r/min,4℃),去除上清液,加入200μL純甲醇終止反應,10min后,經離心10min(700r/min,4℃),去除上清液,然后用70%甲醇洗滌3次,最后1次經離心去除上清液后,于室溫下晾干。待干燥后,加入120μL2mol/LKOH和140μL二甲亞砜(DMSO,Sigma),充分溶解;在酶標儀上測定溶液在波長630nm處的吸光值,以試驗條件下每106個體腔細胞對應的吸光度值來表示RB活性。1.4.5PO活性的測定PO活性的測定參考Hernández-López等的方法,略有改動。取50μLCLS與50μL胰蛋白酶溶液(0.1mg/mL)放入96微孔板中,室溫下溫育10min,然后加入50μL左旋多巴(L-DOPA)溶液(3mg/mL),室溫下溫育10min后,立刻放入酶標儀中,在492nm下測定酶活動力學,以試驗條件下每毫升樣品每分鐘吸光度值每增加0.001定義為一個酶活力單位(U/mL)。1.4.6酸性磷酸酶(ACP)活性的測定采用南京建成生物研究所生產的試劑盒,按照磷酸苯二鈉法測定ACP活性。ACP活力單位定義為每克CLS蛋白質在37℃與基質作用30min產生1mg酚的酶量為1個活力單位(U/gprot)。1.4.7CLS中蛋白質濃度的測定采用考馬斯亮藍法測定CLS中蛋白質濃度,以牛血清蛋白為標準。1.5刺參的半致死濃度養殖8周結束時進行攻毒試驗。攻毒試驗使用的燦爛弧菌(V.splendidus)由中國水科院黃海水產研究所提供。細菌用胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)在28℃下培養24h,然后用無菌生理鹽水沖洗菌落,并調整濃度為108CFU/mL。攻毒試驗前通過預試驗確定刺參的半致死濃度(LD50,7d)為1×107CFU/mL。菌懸液用1mL無菌注射器經腹腔注射對刺參進行攻毒,每頭注射量為0.1mL,繼續投喂基礎飼料,及時記錄刺參的日死亡情況,14d后結束攻毒試驗并統計其累積死亡率。1.6累積死亡率t特定生長率(specificgrowthrate,SGR,%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;累積死亡率(cumulativemortality,CM,%)=100×Dt/D0。式中,W0和Wt分別為初始體重和終末體重;t為試驗天數;D0和Dt分別為攻毒過程中刺參初始頭數和累積死亡頭數。1.7多重比較分析數據以平均值±標準誤表示,采用SPSS13.0對所得數據進行方差分析,當不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)時,采用Tukey法進行多重比較。2有機乳飲料中鉛和銅鋅酵母對刺參特定生長率的影響2.1生長指標由表2可知,飼料中添加硒酵母和維生素E均可顯著影響刺參的特定生長率(P<0.05),二者合用對刺參的特定生長率存在顯著的交互作用(P<0.05)。飼料中不添加維生素E時,各添加水平的硒酵母均可顯著提高刺參的特定生長率(P<0.05),但各添加量之間的差異不顯著(P>0.05);當飼料中添加250mg/kg的維生素E時,100和300mg/kg硒酵母添加組刺參的特定生長率均顯著高于對照組(P<0.05)。硒酵母和維生素E對刺參特定生長率有顯著的交互作用(P<0.05)。同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。Inthesamecolumn,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantlydifferent(P<0.05).Thesameasbelow.2.2有機乳飲料添加量對刺參體腔細胞咀嚼活性的影響由表3可知,飼料中添加硒酵母和維生素E均可顯著影響刺參體腔細胞吞噬活性(P<0.05),二者合用對刺參的吞噬活性存在顯著的交互作用(P<0.05)。飼料中不添加維生素E時,刺參體腔細胞吞噬活性隨著硒酵母添加量的增加有升高的趨勢,且600mg/kg硒酵母添加組刺參的吞噬活性顯著高于100和300mg/kg硒酵母添加組和對照組(P<0.05);當飼料中250mg/kg的維生素E時,未添加硒酵母組和600mg/kg硒酵母添加組刺參的吞噬活性顯著高于300mg/kg硒酵母添加組和對照組(P<0.05)。2.3維生素e對rb活性的影響由表3可知,飼料中添加硒酵母和維生素E均可顯著影響刺參體腔細胞RB活性(P<0.05),二者合用對刺參的RB活性不存在顯著的交互作用(P>0.05)。當飼料中不添加維生素E時,300和600mg/kg硒酵母添加組刺參的RB活性均顯著高于對照組(P<0.05);當飼料中添加250mg/kg的維生素E時,600mg/kg硒酵母添加組刺參的RB活性顯著高于對照組(P<0.05)。2.4不同酵母用量對刺參cls活性的影響由表3可知,飼料中添加硒酵母可以顯著影響刺參CLS中PO活性(P<0.05),添加維生素E對刺參CLS中PO活性影響不顯著(P>0.05),且二者合用對刺參CLS中PO活性無顯著的交互作用(P>0.05)。飼料中不添加維生素E時,各添加水平的硒酵母均可顯著提高刺參CLS中PO活性(P<0.05);當飼料中添加250mg/kg的維生素E時,各水平硒酵母添加組刺參CLS中PO活性均高于對照組,且100和600mg/kg硒酵母添加組刺參CLS中PO活性顯著高于對照組(P<0.05)。2.5硒酵母對刺參cls活性的影響由表3可知,飼料中添加硒酵母和維生素E均可顯著影響刺參CLS中ACP活性(P<0.05),二者合用對刺參CLS中ACP活性存在顯著的交互作用(P<0.05)。當飼料中不添加VE時,刺參CLS中ACP活性隨著硒酵母添加量的增加有升高的趨勢,且300和600mg/kg硒酵母添加組刺參的吞噬活性顯著高于100mg/kg硒酵母添加組和對照組(P<0.05);當飼料中添加250mg/kg的維生素E時,各水平硒酵母添加組刺參CLS中ACP活性均顯著高于對照組(P<0.05)。2.6細菌殘留對累積死亡率的影響由表4可知,飼料中添加硒酵母和維生素E均可顯著影響刺參感染燦爛弧菌后的14d內的累積死亡率(P<0.05),但二者合用對刺參感染燦爛弧菌后的14d內的累積死亡率沒有顯著的交互作用(P>0.05)。當飼料中不添加維生素E時,刺參感染細菌后14d內的累積死亡率隨著硒酵母添加量的升高而降低,但是組間影響不顯著(P>0.05)。當飼料中添加250mg/kg的維生素E時,刺參感染細菌后14d內的累積死亡率隨著硒酵母添加量的升高而降低,且300和600mg/kg硒酵母添加組的刺參感染燦爛弧菌后14d的累積死亡率顯著低于對照組(P<0.05)。3討論3.1有機硒酵母添加對刺參生長的影響硒對于許多動物體都是必需的微量元素,缺硒通常會抑制動物的生長。已有大量的研究報道了飼料中添加外源硒對水產動物的促生長效果。王安利等的試驗表明,添加外源硒組對蝦的增重率較對照組有顯著增加。華雪銘等在異育銀鯽的飼料中分別添加0.3%、0.6%和1.2%的硒酵母,結果表明添加不同濃度的硒酵母均可不同程度地促進異育銀鯽的生長。魏文志等在異育銀鯽飼料中分別添加0.2mg/kg的亞硒酸鈉及0.2mg/kg的硒酵母,添加硒酵母組的增重率和飼料系數與對照組相比有顯著差異。本研究同樣證實了硒酵母的添加可以顯著提高刺參的特定生長率,其促生長的可能原因是:在基礎飼料中,作為硒主要來源的魚粉添加量僅在7%,因此對照組飼料中硒的含量相對較低,其硒含量不能滿足刺參的生長需求,在此基礎上添加外源硒滿足了刺參的生長需求,從而促進其生長。另外,作為有機硒的載體,酵母細胞含有豐富的維生素和營養成分,也可在消化道合成菌體蛋白尤其是B族維生素,具有豐富的營養功能,這也是添加硒酵母能促進刺參生長的可能原因之一。維生素E是一種脂溶性維生素,飼料中維生素E缺乏或過多時都將引起生長減緩。有關維生素E的添加可以促進水產動物生長的研究已經有了較多報道。本試驗中,飼料中添加維生素E同樣可以顯著提高刺參的特定生長率,促進刺參的生長。維生素E促進生長的原因是因為維生素E在體細胞中可阻止對酶有損害作用的氧化自由基的脂類鏈式反應,從而提高了體細胞中生物酶的含量,使機體中的酶反應能持續正常進行。此外,維生素E還能調節體內碳水化合物和肌酸的代謝,提高糖和蛋白質的利用效率,最終提高機體的生長速度和飼料效率。有關維生素E和硒在水產動物應用中的研究,大部分都集中在維生素E和/或硒對魚類生長的影響,而尚未見有關二者同時添加在刺參飼料中的應用效果。本試驗結果顯示,維生素E和硒酵母對刺參的生長有顯著的協同促進作用。3.2飼料中添加碳質素-葡聚糖對克氏原螯蝦肝胰腺組織和魚體內主觀糖質活性的影響陳季強等報道,硒酵母能激活小鼠巨噬細胞的吞噬功能,并能對抗免疫抑制劑所致的巨噬細胞吞噬功能下降,具有增強非特異性免疫功能作用。劉至治等在飼料中添加2.0μg/g亞硒酸鈉、0.5μg/g硒酵母均可以顯著提高中華鱉白細胞的吞噬活性。萬敏的研究也證實飼料中添加硒可以顯著提高皺紋盤鮑的吞噬率。作為有機硒的載體,酵母細胞含有的豐富維生素以及酵母細胞壁中含有的酵母多糖,其活性成分為葡聚糖、甘露寡糖等,已有的研究表明,飼料中添加β-葡聚糖或甘露寡糖可促進養殖動物吞噬活性。本試驗中,飼料中添加硒酵母可以顯著提高刺參體腔細胞的吞噬活性,可能是硒酵母中的硒和酵母細胞壁中多糖共同作用的結果。在對魚類進行的研究中,維生素E可以提高試驗魚的吞噬活性,這與本研究中維生素E的添加可以顯著提高刺參體腔細胞的吞噬活性是一致的。硒酵母和維生素E合用對刺參體腔細胞的吞噬活性存在顯著的正向協同作用,但其中的機制有待于進一步地深入研究。3.3亞硒酸鈉對克氏原螯蝦rb活性的影響在海參中,RB活性最高的組織是吞噬細胞,它可以被多種免疫增強劑刺激得到升高,如維生素C、多糖、甘草酸等。在本研究中,飼料中添加不同水平的硒酵母均可以提高刺參體腔細胞RB活性,且單獨添加100和600mg/kg硒酵母的組刺參的RB活性顯著高于對照組,當飼料中添加250mg/kg的維生素E時,各水平硒酵母添加組刺參的RB活性都顯著高于對照組。在體外培養的羅非魚頭腎吞噬細胞液中分別加入0、5、15和25mg/kg的亞硒酸鈉,結果發現硒可以提高其化學發光峰值,并呈劑量依賴性關系,各試驗組分別比對照組提高3.2%、13.1%和30.8%,這表明硒可以提高吞噬細胞的RB活性。在一些魚類上的研究表明,飼料中添加β-1,3-葡聚糖能增強機體的RB活性。Jorgensen等體外研究表明,0.1~1.0μg/mL酵母來源的β-葡聚糖能夠顯著增強大西洋鮭的頭腎RB活性。本試驗中,添加硒酵母可以顯著提高刺參體腔細胞RB活性,可能是受到了硒和酵母細胞壁中β-葡聚糖的雙重影響。RB產生的活性氧對吞噬阿米巴細胞進行刺激能促使細胞消耗大量氧氣產生超氧陰離子(O-2),進而又產生其他一系列強氧化物,這些強氧化物對病原微生物具有強大的殺傷功能并具有強烈的細胞毒作用,在無脊椎動物抵御外來物質中起到重要作用。Blazer報道指出維生素E能夠避免RB反應過程中產生的自由離子、過氧化物和超氧離子等對巨噬細胞的氧化破壞。有關維生素E可以增強細胞RB活性的研究在魚類上有了較多的報道。Wise等以不同劑量的維生素E飼喂斑點叉尾鮰,可以增強試驗魚白細胞RB能力。Ortuňo等研究發現,飼料中添加維生素E可顯著提高隆頸巨額鯛頭腎巨噬細胞的RB活性。Sealey等試驗證明,維生素E能提高雜交斑紋鱸的RB活性。在本試驗中,飼料中添加250mg/kg的維生素E也可以顯著提高刺參體腔細胞RB活性。3.4不同劑量維生素e對刺參po活性的影響PO又稱酪氨酸酶,系統中PO一般以無活性的酶原(proPO)形式存在于血細胞中。proPO能被微生物或寄生蟲細胞壁中的β-1,3-葡聚糖、脂多糖和肽聚糖等成分激活,將proPO轉變為有活性的PO,將酚氧化成醌,醌能自發形成最終產物黑色素。在該系統活化過程中產生一系列具有生理活性的物質,可通過多種方式參與宿主防御反應,包括提高調理素、促進血細胞吞噬作用、包囊作用和結節形成以及介導凝集和凝固、產生殺菌物質等。本試驗在刺參血清中檢測出PO活性,但飼喂不同劑量維生素E的刺參CLS中PO活性差異不顯著。對酚氧化酶原系統的激活需要微生物多糖,金屬離子等物質的參與,而本試驗使用維生素E可能因體腔細胞無相應受體而無法激活酚氧化酶原系統,而成為酶活性未表現出顯著差異的原因。本研究中,當飼料中不添加維生素E時,刺參的PO活性隨著硒酵母添加量的上升有升高的趨勢。萬敏在對皺紋盤鮑的研究上也得出了相似的結果。有關β-葡聚糖可以提高養殖動物PO活性的研究已經有了相關的報道。Duvic等報道了幾種蝦的血漿中存在β-1,3-葡聚糖結合蛋白(BGBP),該蛋白可以與β-1,3-