單側輸尿管結核大鼠模型中腎臟病理改變及腎組織間質纖維化表達的變化

腎間質纖維是腎疾病發展到最終階段的一起腎衰竭的共同通道。腎間質纖維化發病機制尚不清楚,慢性腎臟疾病發生后,進行性纖維化和慢性腎衰的發生幾乎不可避免,目前臨床缺乏治療良策。建立一種理想的腎間質纖維化動物模型,對于研究腎間質纖維化發生機制以及探尋各種延緩和阻斷腎纖維化進展的新方法,具有十分重要意義。本研究采用單側輸尿管結扎(unilateralureteralobstruction,UUO)的方法快速建立了研究腎臟細胞轉分化和腎間質纖維化的理想動物模型。1腎組織病理學檢測1.1實驗動物及分組60只清潔級雄性SD大鼠,體重150~200g,由本校實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為2組,SOR組30只和UUO組30只。1.2動物模型的建立單側輸尿管結扎:5%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛,常規消毒鋪孔巾,選擇腹正中線切口,依次切開皮膚至腹腔,游離腎臟及輸尿管,將左側輸尿管用組織鉗托起中段部位,止血鉗夾住,在兩端用4-0絲線兩次結扎左側輸尿管近腎盂段,剪斷輸尿管,然后連續縫合皮膚。假手術組(SOR)手術入路方式同UUO組,進腹腔后分離左輸尿管但不結扎輸尿管。隨機選取每組中的6只大鼠分別于術后3天、7天、14天、21天和28天處死,處死前一天將大鼠置于代謝籠中(禁食,不禁水),收集24h尿液測尿量,大鼠24h尿經離心(2000r/min,10min),去除沉渣。水合氯醛麻醉后,右股動脈采血,血液收集后經離心分離出血清。尿液和血清均保存于-20℃冰箱;取左腎組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋。1.3檢測方法1.3.1生化指標的測定全自動生化分析儀(OLYMPUSAU5400)檢測尿蛋白、血清肌酐及尿素氮。1.3.2腎臟常規病理檢查腎組織經固定,包埋,切成3μm厚石蠟切片,經蘇木素-伊紅(HE)、過碘酸希夫反應染色(PAS)及馬松三色染色(Masson),光鏡下觀察腎小管間質病變。由兩個觀察者對每個樣本腎組織的HE染色進行盲法評分,取兩觀察者評分的平均值。(1)小管間質損傷評分按文獻描述的方法,半定量腎小管間質的病變。200倍光鏡下,每張切片隨機選擇10個不含腎小球的視野。腎小管間質病變由3個參數判定(蛋白管型和腎小管的擴張;間質炎細胞的浸潤;間質纖維化的程度)。每個參數按0~3分評定(0=正常,1=輕度受損,2=中度受損,3=重度受損)。每個樣本小管間質的評分為0~9分。(2)腎間質浸潤的炎細胞計數按文獻描述的方法,400倍光鏡下,每張切片隨機選擇10個不含腎小球的視野,計數腎間質內浸潤的炎細胞(單核巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞)。結果以(炎細胞數/HP×400)表示。1.3.3免疫組織化學采用SP法。3μm厚石蠟切片脫蠟水化后經3%H2O2孵育滅活內源性過氧化物酶,高壓鍋抗原修復,山羊血清封閉后,分別滴加兔抗大鼠FN抗體(武漢博士德公司1∶200),α-SMA抗體(武漢博士德公司1∶150)孵育,再依次加入生物素標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液孵育。DAB顯色,蘇木素復染,常規脫水、透明、封片鏡檢。每次染色均以PBS代替一抗作陰性對照。1.3.4圖像分析NickonspotcoolCCD采集圖像,采用ImageProplus4.02多媒體彩色病理圖象分析軟件進行分析。經灰度變換將陽性染色與背景分開進行自動測量。(1)腎間質相對面積測定取Masson染色切片,每例切片選取20個不重疊的200倍視野,計算腎間質面積與腎小管間質總面積(去除腎小管管腔)比值,取其平均值為每例切片的腎間質相對面積。(2)腎小管間質α-SMA、FN免疫組化染色陽性面積測定在每張不包含腎小球和血管的腎小管間質區域隨機選取15個不重疊的200倍視野,計算每個視野內陽性染色區域的面積密度平均值。1.4統計學處理數據資料用ˉx±s表示,采用SPSS10.0統計軟件處理。組間差異采用單因素方差分析(One-wayANOVA)。組間兩兩比較用SNK檢驗法。α-SMA、FN表達與腎小管間質損傷評分(TIS)、腎間質相對面積之間的關系判斷采用Pearson相關分析。P<0.05為有統計學意義。2結果2.1白定量uio大鼠血尿素氮、胱肌蛋白檢測結果尿蛋白的濃度各個體之間差異較大,但每日排出總量差異較小。24小時尿蛋白定量UUO組與假手術組比較無統計學差異。UUO術后7~14天,大鼠出現明顯血尿素氮、肌酐值升高。術后21~28天通過對側腎臟的代償,血尿素氮、肌酐值反而下降,但28天時血肌酐值仍然比SOR組高(見表1)。2.2炎癥細胞+相關組織病理學檢測SOR組各時間點腎臟病理未見改變。UUO術后3天可見腎間質水腫,遠端小管擴張,而近端小管擴張不明顯,遠端小管上皮細胞扁平、間質增寬,失去“背靠背”特征,小管間質內有散在炎細胞浸潤,但小球結構正常;Masson染色見皮髓交界處出現輕微纖維化。UUO術后7天,大量炎癥細胞浸潤,部分近端小管空泡變性,管腔內可見脫落上皮細胞,外髓、皮髓交界處小管擴張更加明顯。術后14天,炎癥細胞浸潤及細胞增殖明顯,部分小管消失,集合管、遠端小管擴張呈囊狀,部分近端小管保存尚好,皮質變薄。術后21天,髓質小管更加減少,皮髓質變薄,小管空泡變性明顯,大量炎癥細胞浸潤及細胞增殖。術后28天,炎癥細胞浸潤有所減少,近端小管空泡變性顯著,皮質極薄,擴張小管數量減少,部分小管萎縮消失,纖維化明顯;PAS染色見彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮;Masson染色見皮質區、皮髓交界處纖維化明顯,而腎小球仍無明顯病變。UUO組腎小管間質損害評分(TIS)及腎間質炎細胞浸潤變化見圖1、2。2.3腎間質中纖維連接蛋白的表達假手術組中以血管作為自身陽性內參照,腎小球、腎小管和間質細胞均無α-SMA表達。UUO術后3天,腎間質中α-SMA陽性細胞數增多;術后7天,見少許腎小管上皮細胞也有α-SMA表達,術后14天,可見較多的腎小管上皮細胞表達α-SMA。假手術組的FN在各個時間點腎間質中只有少量表達,UUO術后3天,腎間質中纖維連接蛋白(FN)表達明顯增加。α-SMA和FN表達均隨著腎小管間質損害加重進一步增加。兩者在UUO術后腎小管間質的表達變化見圖3,4。2.4染色面積、-sma陽性染色面積、間質相對面積、tis成相關分析對腎小管間質中α-SMA、FN表達與TIS、間質相對面積進行相關分析發現,α-SMA陽性染色面積與FN陽性染色面積成正相關(r=0.996,P<0.01),α-SMA陽性染色面積與間質相對面積、TIS成正相關(r分別為0.985、0.972,P<0.01),FN陽性染色面積與間質相對面積、TIS成正相關(r分別為0.969、0.953,P<0.05)。3腎間質纖維化的表達及病理改變目前的研究證實,腎臟間質纖維化程度與腎功能減退的相關性,比腎小球硬化與腎功能減退的相關性更為密切。臨床上,輸尿管梗阻是導致腎纖維化的常見原因。為此,我們采用UUO的方法建立腎間質纖維化模型,觀察了梗阻過程中大鼠腎功能變化及腎臟組織的病理改變。結果發現,單側輸尿管結扎后,短期內(術后7~14天)大鼠出現明顯血尿素氮、肌酐值升高。術后21~28天,血尿素氮、肌酐值反而下降,但術后28天時血肌酐值仍然比假手術組高。提示單側輸尿管梗阻后腎功能有一個急性失代償到逐漸通過對側腎臟代償,最后對側腎臟亦失代償的變化過程,此與梗阻后引起腎內壓、腎臟血流動力學和腎小球濾過壓改變有關。UUO術后28天內,24小時尿蛋白排泄量無明顯增加,估計與UUO模型病變特點為腎實質被纖維組織取代,而腎小球相對不受影響有關。腎間質纖維化以腎間質中細胞及膠原成分聚積增多,伴有腎小管萎縮或擴張變形為特征。我們觀察到,UUO術后3天,腎組織已出現炎細胞浸潤、細胞增殖、小管擴張等病理改變,此后呈進行性小管萎縮及間質纖維化。但整個UUO術后觀察期內,即使術后28天小管間質病變已十分嚴重,腎小球仍無明顯病變,與文獻報導相符合,也表明了該模型腎臟病理改變的特點。UUO術后3天,已可見梗阻側腎臟發生早期間質纖維化損害,表現為成肌纖維細胞激活(腎間質中α-SMA陽性細胞數增多),FN過表達,間質相對面積增加,一直持續到術后28天。而且術后7天,可見少許腎小管上皮細胞表達α-SMA,術后14天,α-SMA陽性的腎小管上皮細胞數明顯增多,與國外文獻報道基本一致。α-SMA是平滑肌和肌成纖維細胞的標志蛋白。腎小管上皮細胞α-SMA染色陽性說明這些腎小管上皮細胞可能發生了上皮-間質轉分化。近年研究表明,腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化是腎間質纖維化發生發展的重要機制。“表型轉化”理論認為,病理狀態下腎小管上皮細胞可轉分化為肌成纖維細胞,獲得α-SMA表達的轉分化腎小管上皮細胞及間質細胞可具備肌成纖維細胞的特征如收縮功能及分泌膠原,產生細胞外基質(ECM),導致腎間質纖維化發生發展。其中,FN也是由活化的成纖維細胞分泌的性質尚未明確的蛋白質,它除了作為ECM成分之一,還可進一步激活炎癥細胞,最終促使腎間質的纖維化。而相關性分析顯示α-SMA表達與FN表達呈正相關,提示FN增加與肌成纖維細胞數量增多有關。α-SMA表達與TIS、間質相對面積的相關性也提示肌成纖維細胞數量在腎纖維化及腎功能損害中起著重要的作用。由此可見,UUO模型是研究腎臟細胞表型轉化的理想模型。在此種動物模型中,另一突出的病理改變是間質區的細胞增殖和炎癥細胞浸潤。我們發現,假手術組腎臟有極少巨噬細胞主要位于腎小球,髓質中完全沒有白細胞,與文獻報道一致。而UUO組中,腎臟皮質和髓質均可見單核細胞。UUO術后3天,小管間質內為散在炎細胞浸潤。術后21天,炎癥細胞浸潤及細胞增殖最明顯。術后28天,炎癥細胞浸潤反而有所減少。許多研究已證實,腎間質纖維化過程中涉及多種腎臟細胞,包括成纖維細胞、小管上皮細胞、巨噬細胞以及淋巴細胞等。因此,UUO術后21天是研究腎間質纖維化發病機制,尤其是增殖細胞和炎癥細胞功能的最佳時期。UUO模型與其他多種慢性腎疾病模型不同,例如5/6腎切除模型、糖尿病腎病模型,通常需要花費數月才會建立起纖維化模型。而我們發