人骨肉瘤細胞mg63中foxm1基因表達及對細胞增殖與凋亡的影響

中國腫瘤防治雜志，2014年21（20）：1575-1579。骨肉瘤是最常見的原發惡性骨腫瘤,其惡性程度高,血行轉移發生早,具有較高的局部浸潤和早期轉移傾向,是導致患者死亡最主要的原因。ForkheadboxM1(FoxM1)是叉頭框轉錄因子家族成員之一,基因定位于12p13-3,長約23kb,普遍表達于增殖活躍的細胞,與DNA損傷修復、組織穩態及細胞凋亡等過程密切相關。近年來研究表明,FoxM1在多種惡性腫瘤中均存在高表達,其中包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。FoxM1在人骨肉瘤中亦存在高表達現象。本研究以特異性siRNA干擾骨肉瘤細胞株FoxM1表達,觀察其對細胞增殖與凋亡的影響,初步在細胞與分子水平了解FoxM1調控細胞增殖與凋亡的機制。1材料和方法1.1試驗兔抗兔模型人骨肉瘤細胞株MG63和SOSP-9607由第四軍醫大學唐都醫院全軍骨腫瘤研究所保存。MEM和RPMI1640培養基購于美國Corning公司,胎牛血清購于美國Gibco,胰蛋白酶和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于美國Sigma公司,LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司,二甲基亞砜(DMSO)購于美國Ventec公司,酶標儀(Bio-Rad680,USA),低溫離心機(Beckman,USA);兔抗人FoxM1、β-actin(CST,USA)HRP標記羊抗兔IgG購于美國Pierce公司,TotalRNAKitⅡ購于美國OMEGA公司,PrimeScriptRTreagentkit、RealtimePCRkit購于日本TaKaRa公司,FOXM1-siRNA及陰性對照siRNA序列由上海吉瑪公司合成。流式細胞術檢測在第四軍醫大學基礎部免疫學教研室進行。1.2細胞培養及轉染MG63和SOSP-9607細胞分別培養于含10%胎牛血清的MEM和RPMI1640培養基中,置于37℃、5%CO2中傳代培養,并取對數生長期的細胞用于實驗。1.3sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳取生長狀態良好的MG63和SOSP-9607細胞,冰上裂解細胞提取總蛋白并BCA法進行定量,調整樣品濃度。上樣30g/孔,行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,100V濕轉90min;含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2h;抗FoxM1和抗β-actin4℃孵育過夜,相應二抗室溫2h;洗滌后ECL顯色,置入儀器觀察,拍照記錄。1.4g膜轉染及細胞培養針對FoxM1的特異性siRNA正義鏈為5′-GGA-CCACUUUCCCUACUUUTT-3′,反義鏈為5′-AAA-GUAGGGAAAGUGGUCCTT-3′;陰性對照序列正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉染前將MG63細胞以每孔1×105的密度接種于6孔板中培養,待細胞處于對數生長期并且融合度達60%時進行轉染。將MG63細胞分為實驗組、陰性對照組和空白對照組,前兩者分別轉染特異性siRNA和陰性對照siRNA,空白對照組細胞不處理,每組設3個復孔。轉染時以Opti-MEM無血清培養基稀釋siRNA序列與LipofectaminTM2000,參照LipofectaminTM2000說明書進行,轉染終體積為2mL/孔,siRNA轉染濃度為100nmol/L,轉染后8h換液,添加含胎牛血清10%的培養基。實驗重復3次。1.5rt-pcr檢測于轉染后72h收集各實驗組細胞,提取總RNA,采用SYBRGreenⅠ染料法檢測各組細胞FoxM1基因表達水平。FoxM1基因PCR引物序列上游為5′-G-AAGAACTCCATCCGCCACA-3′,下游為5′-GCCT-TAAACACCTGGTCCAATGTC-3′;β-actin引物序列上游為5′-TGGCATTGTTACCAACTGGGTC-3′,下游為5′-TCACGGTTGGCCTTAGGGTTC-3′。按熒光實時定量RT-PCR試劑盒說明書進行,PCR反應條件94℃預變性6min,95℃變性10s,60℃退火1min,共進行40個循環;循環結束后71℃保溫30s,所得結果進行讀數分析。采用相對定量法,分析實驗組、陰性對照組及空白對照組細胞轉染48h后的ΔCt值,計算ΔΔCt,進而換算為2-ΔΔCt(設空白對照組表達量為1),即為轉染48h后各組FoxM1相對表達量。1.6總蛋白的提取采用蛋白質印跡法檢測。轉染后72h收集各組細胞各3孔,裂解并提取總蛋白,其余步驟同實驗1.3。各組蛋白表達的灰度值利用QuantityOne進行測定,以FoxM1蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為FoxM1基因的蛋白表達水平。1.7實驗細胞和人工誘導的活性人基因文庫建立采用MTT法檢測,實驗分組同1.4。將MG63細胞以8×103個/孔接種于96孔板培養,每組細胞設4個復孔,周邊孔以無菌雙蒸水代替,共鋪4塊96孔板,培養過夜,于對數生長期按照實驗1.4轉染特異性siRNA及陰性對照siRNA。在轉染后24、48、72和96h各取1塊96孔板,加入新鮮MTT溶液20μL/孔;37℃孵育4h后,避光小心吸取上清液,每孔加入200μLDMSO溶解,酶標儀中震蕩10min,在490nm(參考波長630nm)處測量并記錄每孔的光密度A值(A490)。每組細胞4復孔光密度A值取平均值,以時間為橫坐標,A平均值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。實驗重復3次。1.8細胞凋亡檢測采用流式細胞儀檢測,實驗分組同1.4。轉染后72h用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞,培養基洗滌1次,AnnexinⅤ-PI法上機檢測細胞凋亡。實驗重復3次。1.9多因素方差分析采用SPSS18.0進行統計學分析,計量資料以ue0af±s表示,對多個樣本均數進行完全隨機設計的單因素方差分析(One-wayANOVA),各均數間兩兩比較行LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。2.結果2.1基因發現福斯圖1蛋白質印跡法檢測結果顯示,在人骨肉瘤細胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1基因的表達。2.2各組機構間增強黨員社區開發ccm1mrna的表達水平比較圖2Real-timePCR檢測結果顯示,實驗組、陰性對照組和空白對照組FoxM1mRNA表達水平分別為0.39±0.09、0.91±0.07和0.96±0.08,3組間FoxM1mRNA表達水平不同,F=46.22,P<0.001;實驗組FoxM1mRNA表達水平顯著低于陰性對照組,t=7.92,P<0.001,比陰性對照組下降64%;也低于空白對照組,t=8.68,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義,t=0.76,P=0.475。2.3組間保血蛋白表達水平比較圖3蛋白質印跡法檢測結果顯示,實驗組、陰性對照組和空白對照組FoxM1蛋白表達水平分別為0.31±0.06、0.81±0.10和0.89±0.09,3組間FoxM1蛋白表達水平不同,F=40.98,P<0.001;實驗組FoxM1蛋白表達水平顯著低于陰性對照組,t=7.20,P<0.001,比陰性對照組下降約60%;也低于空白對照組,t=8.35,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義,t=1.15,P=0.29。2.4各組間增殖率圖4MTT檢測結果顯示,實驗組、陰性對照組和空白對照組MG63細胞增殖率分別為0.36±0.03、0.61±0.02和0.65±0.02,3組間增殖率不同,F=130.77,P<0.001;實驗組增殖率顯著低于陰性對照組,t=12.86,P<0.001;也低于空白對照組,t=14.92,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義,t=2.06,P=0.085。2.5各組凋亡率的情況圖5流式細胞術結果顯示,實驗組、陰性對照組和空白對照組MG63細胞凋亡率分別為(13.69±1.15)%、(2.38±0.90)%和(2.87±0.86)%,3組間凋亡率不同,F=128.075,P<0.001;實驗組凋亡率顯著高于陰性對照組,t=14.16,P<0.001;也高于空白對照組,t=13.54,P<0.001;陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義,t=0.61,P=0.562。3核心分子—討論FoxM1作為人FOX轉錄因子家族中的一員,是經典的增殖相關因子,與PIK-1、Survivin和CDC25B等有絲分裂因子相互作用調控細胞周期的進程,進而影響細胞增殖與凋亡。FOXM1表達水平與細胞增殖密切相關,其異常高表達對腫瘤細胞不可控性的惡性增殖意義重大,在惡性腫瘤的發生與發展過程中發揮了重要作用,涉及腫瘤細胞的增殖、凋亡、耐藥與損傷修復等。Nakamura等報道,在127例急性髓細胞白血病(acutemyeloidleukemia,AML)臨床標本中均存在FoxM1的過表達,并可調控Survivin和CyclineB等周期相關蛋白的表達;Gialmanidis等報道,FoxM1在非小細胞肺癌中的表達明顯高于癌旁正常肺組織,并與PTCH1和GLI1等HedgeHog信號通路蛋白相關,而后者與腫瘤的分級相關;Sun等研究證實,FoxM1的表達與肝癌分期、分級和大小等密切相關,可一定程度上提示患者的預后;Ahmad等研究發現,乳腺癌細胞中FoxM1的過表達,可使細胞的增殖速度明顯提高,侵襲、轉移能力明顯增強;與此同時,FoxM1與腫瘤的藥物敏感性密切相關,Gartel研究報道,不同腫瘤細胞株中加入噻唑類抗生素可通過抑制FoxM1的表達而加速細胞凋亡,提示FoxM1存在成為抗腫瘤藥物作用靶點的可能。隨著骨肉瘤臨床與基礎研究的進步,目前治療以新輔助化療支持下的保肢綜合治療為主,使患者的5年生存率有了明顯的提高,并改善了患者的術后生活質量,盡管如此,我國骨肉瘤患者5年生存率為7.5%~77.6%,平均生存率為64.0%。近年來,骨肉瘤分子靶向治療取得了一定的研究成果,出現了多個治療靶點,但療效尚不夠理想,基礎研究向臨床應用的轉化率還很低。因此,探索骨肉瘤發生發展中的重要相關分子,尋找誘導腫瘤細胞凋亡的新藥物,對骨肉瘤的治療具有重要意義。近年來研究表明,FoxM1在骨肉瘤中亦存在異常高表達現象,Wang等研究指出,在骨肉瘤細胞中FoxM1通過活化JNK1調節細胞周期;Grant等報道,在骨肉瘤細胞株中FoxM1可激活多個G2/M期和S期特異性基因的啟動子,從而對骨肉瘤的細胞增殖起到調控作用。但FoxM1影響骨肉瘤發生與發展的分子機制仍未完全闡釋。RNAi干擾技術是一項近年來逐漸成熟的生命科學技術,可特異性剔除或關閉特定基因的表達,被廣泛應用于探索基因功能及惡性腫瘤的基因治療等眾多領域。本研究采用蛋白質印跡法檢測到在兩種骨肉瘤細胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1的表達,并利用siRNA干擾技術對FoxM1在細胞增殖與凋亡中的作用進行了初步探討,發現實驗組細胞轉染特異性siRNA后,與轉染陰性對照siRNA的對照組和空白對照組細胞相比,FoxM1在mRNA和蛋白水平表達顯著下調,增殖率顯著受到抑制,細胞凋亡明顯增加。這與已報道的文獻結果相吻合。其可能作用機制是FoxM1蛋白與PIK-1、Survivin和CDC25B等有絲分裂因子相互作用,阻斷細胞周期,