計算化學方法在藥物分子設計中的應用

眾所周知，化學小分子藥物是通過結合體內的生物大靶點來影響生物功能并發揮療效的。藥物分子的幾何形狀和藥效基團配置與其受體蛋白上的結合位點的空間形狀和功能基團分布是互補的,這種互補性的好壞決定了受體和藥物分子的相互識別和相互結合的強弱程度。隨著人類基因組學、蛋白質組學和結構生物學研究的進展,以及與疾病相關基因啟動、表達和調控機制研究的深入,許多與疾病密切相關的新的分子靶標及其結構和功能的分子機制已被揭示和闡明。因此,利用計算化學手段,根據特定疾病相關的靶標分子的三維結構來定向設計結構、性質互補的小分子配體,使它們能夠特異性地調控這些靶標分子的功能,從而預防疾病的發生、減緩和終止疾病的發展,能大大降低和縮短尋找新藥的成本與周期。目前在蛋白質結構數據庫中有超過88000套通過X射線晶體學衍射和核磁共振技術解析的大分子三維結構數據,并以更快的速度逐年遞增;同時,得益于近年來計算能力的迅猛增長及研究大分子體系的理論和算法的日趨成熟,基于靶點結構的藥物分子設計方法(structure-baseddrugdesign,SBDD)在新藥開發過程中已經得到廣泛應用,設計成功的最新的臨床藥物包括BRAF激酶抑制劑vemurafenib(圖1)、ALK激酶抑制劑crizotinib等。從藥物靶標出發的新藥研發流程如圖2所示,其中先導化合物的尋找和優化是關鍵,合理應用計算化學方法可以起到事半功倍的效果,包括(c)靶標成藥性評估、(d)基于靶點結構的化合物庫虛擬篩選和(f)先導化合物的結構優化。目前,藥物靶標的確定一般是根據其生物學的意義,但并不是所有的生物學大分子受體都有適合小分子藥物結合的位點,因而大量的生物學靶標都缺乏成藥性(druggability,即與類藥性小分子以較高親和性結合的能力)。據統計,國外50%左右的基于新靶點的藥物開發項目失敗的原因是尋找不到較高結合活性的配體小分子,所以在新藥開發的初始階段定性甚至定量評估某靶點的成藥性極其關鍵。在藥物靶標確定和三維結構已知的情況下,基于結構的虛擬數據庫篩選方法利用分子對接技術自動地匹配受體結合腔穴和化合物數據庫中的小分子三維結構,然后利用基于分子力學力場的能量函數或者經驗性函數對這種分子對接的模式進行打分,進而選擇與受體相互作用最好的一組化合物進行生物活性測試,從而可以大大節省尋找先導化合物的費用和難度。在先導化合物確定之后,尤其是在解析先導物-受體復合物結構的基礎上,利用溶液體系中自由能微擾方法精確計算化合物結構改造對其靶點結合活性的影響,目前最精確的計算結果可以達到實驗測量的誤差范圍之內(1kcal·mol-1),能顯著減少在先導物優化過程中需要合成的衍生物的數目。在此就計算化學在基于受體結構的藥物設計中關鍵的切入點展開系統論述,同時對目前的方法及應用中存在的主要問題進行探討,提出切實可行的處理策略。1平衡解離常數的影響藥物分子和受體分子的結合遵循分子識別(molecularrecognition)過程中的普遍規律(圖3),即由自由能(freeenergy)驅動。分子識別過程中,去溶劑化效應扮演重要角色。因為受體和配體在結合前都完全處于由水分子組成的溶劑環境中,結合過程中配體會擠走原來占據結合位點的水分子,從而帶來水分子熵的增加。其次,當受體和配體相互接近時,由于相互作用力的趨動,二者的三維構象都會發生不同程度的誘導契合(inducefit),例如蛋白質氨基酸側鏈的轉動、loop的移動、大尺度結構域的挪動、以及配體小分子可旋轉單鍵的構象變化。同時,受體-配體的結合還要滿足相互作用力的匹配,包括氫鍵的形成、有利的靜電和范德華相互作用、π堆積以及疏水相互作用等非共價鍵作用。藥物分子對靶點的親和能力就是這些效應綜合疊加的結果,用平衡解離常數Kd表征。這些效應相互抵消或者增強,對于不同的受體-配體體系,不同效應的貢獻不同,如何利用經典物理學理論精確評估這些能量項是目前計算化學發展中的一個重要領域,極具挑戰性。2“典力學”的優勢分子力學(molecularmechanics,MM)能夠對生物大分子體系進行較為真實的模擬和計算,是目前應用最普遍的研究手段。分子力學方法基于經典力學,具有以下幾個優勢:(1)不需要通過擬合已知配體的結合數據;(2)可通過更精確的計算模型和采樣方案系統地改進打分函數;(3)不局限應用在某些特定的體系,具有廣泛的適用性。因此,本文把基于經典物理學原理的分子力學方法作為討論的重點,而一些基于經驗歸納和數據擬合的方法如定量構效關系(quantitativestructure-activityrelationship,QSAR)等,雖然對藥物開發同樣發揮著重要作用,但不屬于本文所探討的范疇。2.1模擬步幅的計算方法分子力學的核心是分子力場(forcefield),包括勢能量函數的形式及其相應的力場參數。力場勢能量函數通常包括鍵長、鍵角、二面角等反映分子內成鍵原子間作用的共價鍵項,以及反映非成鍵原子間相互作用的范德華、靜電等非共價鍵項。在力場計算的基礎上,利用牛頓運動定律模擬原子隨時間動態變化的過程,就產生了分子動力學方法(moleculardynamics,MD)。在分子動力學模擬中,每個原子位置的變化遵守經典力學規律。每隔一個模擬步幅,分子中的各個原子移動到新的位置,由此時的三維空間坐標可以根據力場求出勢能梯度,進而計算每個原子所受到的來自體系中其他原子的力,然后求出加速度,最后求出新的位置。如此循環下去,就可以得到描述體系各個原子位置、速度和加速度隨時間變化的運動軌跡。根據各向異性假設,也就是系統在長時間內的取樣平均等價于系綜平均,通過統計力學方法計算,可以將分子動力學軌跡中包含的微觀信息同宏觀物理化學性質聯系起來。這樣不但可以提供實驗中很難測定的高精度動態微觀結構信息,還可以通過理論計算得到宏觀熱力學量,從而可以用于預測實驗測量數值,如結合自由能。基于上述分子力學理論,根據模型復雜程度和計算精度的高低發展了不同類型的方法(表1):包括分子對接(moleculardocking)、MM/GB-SA重打分方法、MM/PB-SA自由能計算方法、自由能微擾(freeenergyperturbation,FEP)和熱力學積分(thermodynamicintegration,TI)方法等。在實際應用中,需要根據研究目的應用不同的計算方法。例如,在先導化合物的發現過程中,對大規模數據庫(通常包括幾十萬到幾百萬個化合物)進行快速篩選,就要求用非常簡化的模型和計算方法實現快速的評估(如分子對接);在隨后基于先導化合物的結構改造中,候選分子的數目較初篩時大大減少(通常為幾十到幾百個化合物),就可以用更精確的物理模型和更復雜的計算方法進行結合自由能計算(如FEP)。下面分別介紹這些方法。2.2基于剛性受體的轉換模型1982年,Kuntz等首次提出了分子對接的策略和算法,并將其應用在受體-配體結合的研究中。現在,分子對接方法已發展成一種根據幾何形狀、物理化學性質互補原則在受體的結合口袋內自動定位、取向、評估配體小分子的成熟技術,并在學術界得到廣泛應用。對接主要可分為兩個步驟:對受體和配體分子進行三維構象空間的搜索(sampling)和利用打分函數對所有可能的結合模式進行能量評估(scoring)。配體小分子由于結構簡單,構象空間有限,一般可采用對所有可旋轉鍵進行固定步長的系統搜索(DOCK)或隨機搜索(AUTODOCK)的策略。而受體大分子結構復雜、柔性鍵數目眾多,很難實現完整、有效的采樣,因此目前普遍應用的仍然是基于剛性受體的對接模型。近年來,分子對接方法成功應用于先導化合物發現的實例有很多報道,尤其是針對受體結合腔穴和酶催化位點。以β2腎上腺素受體為例,Kobilka和Schoichet研究組合作,在晶體結構的基礎上利用DOCK3.5.54軟件對接篩選了ZINC數據庫中近一百萬個化合物,對排名較高的25個候選化合物進行實驗驗證,發現有6個化合物的Ki小于4μmol·L-1,最好的為9nmol·L-1,是目前最有效的反向激動劑(圖4)。相對而言,利用分子對接方法篩選阻斷蛋白-蛋白相互作用的成功案例較少。其中,MacKerell實驗室針對LCK激酶的SH2結構域,對接篩選了兩百萬個小分子化合物,最終挑選測試的194個化合物中有34個能夠阻斷SH2介導的蛋白相互作用,最終有13個化合物在淋巴細胞模型上顯示活性。2.3基于能量優化的mm/gb-sa方法眾所周知,生物體系處于水環境之中,水分子參與了受體-配體的相互作用,對于研究分子識別過程具有重要意義。但在實際模擬中為使計算收斂需要進行大量的采樣,時間較長、成本很高。隱式溶劑模型通過把溶劑環境近似地表示成連續的偶極介質,減少了評估水分子之間或水分子和溶質分子的相互作用,節省了計算成本。目前,使用最廣泛的隱式溶劑模型是通用波恩-表面積(GB-SA)和泊松-玻爾茲曼-表面積(PB-SA)方法。2002年,Jacobson等合作開發出一套基于OPLS全原子力場和GB-SA隱式溶劑模型的蛋白結構預測和優化方法:蛋白質局部優化程序(PLOP)。隨后幾年,Jacobson研究組把該方法系統應用到了受體-配體相互作用的相關研究,包括優化配體結合構象、提高虛擬篩選中陽性化合物的富集率、配體的相對結合自由能的計算、以及蛋白結合位點的成藥性的預測等多個方面。這種基于能量優化的MM/GB-SA方法一定程度上考慮了配體分子與受體結合后帶來的“誘導契合”效應,并在計算結合能時加入了分子內能量和溶劑化自由能,在模型真實度和計算準確度上都有提高。Huang等的研究工作表明,對分子對接結果進行MM-GB/SA重打分,不但可以顯著提高虛擬篩選的富集率,甚至可能有助于預測配體分子的選擇性。最近,Jacobson研究組利用MM-GB/SA方法研究了12個不同的蛋白體系,每個體系都包括了一定數目的同系列化合物,計算預測的結果和實驗結合數據呈現了很好的相關性,11個體系超過90%的配體分子被正確地預測出排名情況。但是這種策略在采樣空間上有限,而且打分函數中沒有考慮受體-配體結合過程中熵的變化,從模型近似和計算成本的角度,它可以看作是介于分子對接和基于動力學采樣的自由能計算方法(如MM/PB-SA、FEP等)之間的過渡。2.4深刻反應和最優條件選擇2000年,Kollman研究組提出一種基于分子動力學模擬的系綜平均自由能的計算方法:MM/PB-SA。通過特定的熱力學循環,MM/PB-SA把受體-配體在水相中的結合自由能分解成氣相結合自由能和溶劑化自由能,分別在水溶液環境對體系在始態(非結合狀態)和終態(復合物)情況下進行分子動力學模擬并記錄平衡狀態下溶質分子的運動軌跡,結合力場相互作用能計算和隱式溶劑模型(PB/SA)計算體系在始態、終態的系綜平均自由能差值。理論上講,MM/PB-SA在物理模型和計算策略上都更接近真實情況。2001年,Wang和Kollman等對HIV-RT的12個TIBO類型的抑制劑(圖5A)進行了MM-PB/SA計算,理論預測的結果無論從相對排名還是絕對自由能數值都和實驗結果高度吻合(絕對自由能和實驗值的RMSD僅為1.0kcal·mol-1)。尤其是,預測的HIV-RT藥物Efavirenz(圖5B)和受體蛋白的結合模式與隨后發表的藥物-受體復合物的晶體結構(圖5C)非常相似(RMSD為1.1埃)。但是,和其他基于動力學采樣的方法一樣,長時間模擬所消耗的計算成本限制了MM/PB-SA在大規模篩選中的應用。2.5代金配體的取代基變化對配體自由能計算的影響在實際應用中,通常需要預測一系列配體小分子對單個靶點的相對親和性。相比于直接計算不同配體小分子對特定受體的絕對結合自由能,間接計算在不同狀態下(溶劑中和蛋白質結合腔穴內)配體分子的構型轉換或化學結構微擾的自由能差值更容易實現。這種由配體分子的結構微擾帶來的體系自由能的變化可以通過嚴格的統計力學方法在分子動力學采樣或蒙特卡羅模擬的基礎上精確求解,主要方法有自由能微擾(FEP)和熱力學積分(TI)。理論上這些方法能將體系的自由能和能量函數的系綜均值聯系起來,在水溶液環境中計算配體的取代基變化對配體相對結合自由能的影響,結果可以直接和實驗測量值相對應(誤差可在1kcal·mol-1之內)。但是對于結構變動較大的化合物,或是計算配體與受體的絕對結合自由能時,這些方法仍然面臨著巨大的挑戰。Kollman等曾經倡導用這些方法進行前瞻性的藥物設計,并進行了大膽的嘗試。然而,利用這些方法進行的大多數研究工作仍然停留在對已報道數據的回溯性研究,滿足于計算結果能夠重復已有實驗數據,缺乏真正意義上的預測性。非常典型的一個案例是Jorgensen課題組在開發HIV非核苷類逆轉錄酶抑制劑的過程中,運用蒙特卡羅模擬和FEP理論(MC/FEP)指導結構優化過程,迅速地把多個微摩爾級別的先導化合物優化成為納摩爾級別的抑制劑。以化合物9(EC50值為900nmol·L-1)為參照,通過對其結構進行一系列的微擾設計(雜原子取代)和自由能計算,預測出新的化合物11和10的活性較好(ΔΔG分別為-7.1和-5.3kcal·mol-1),隨后的生物學實驗驗證這些化合物確實是系列改造物中活性最強的(EC50值分別為5和6nmol·L-1),相比于先導化合物有了數百倍的提高。更值得一提的是,對于其中的一些同分異構體分子(如化合物9、12和13,設計策略是“氮原子遷移”),也成功地預測出與實驗結果(EC50值:900→130→19nmol·L-1)高度一致的活性變化趨勢(ΔΔG:0→-4.2→-6.1kcal·mol-1)(圖6)。3對接技術的應用關注到問題如上所述,基于結構的藥物設計始于藥物靶點的確定,如何運用計算的手段預測生物大分子的成藥性具有重要意義。對于已確認的藥物靶點,運用分子對接方法虛擬篩選是先導化合物發現的重要手段,針對該方法的研究和改進一直是計算化學領域的熱點問題,如何系統、客觀地評價各種不同的對接技術就成為亟待解決的問題。另外,由于理論方法的實現和計算成本的局限,一些在受體-配體結合過程中發揮重要作用的因素在現有的對接技術中未能有效考慮:如受體的柔性、溶劑效應和熵貢獻等。下面針對這些主要問題進行初步探討。3.1靶標蛋白的成藥物分析靶點蛋白的成藥性(druggability),即其可被小分子藥物結合并調控的可能性,是決定藥物研發能否獲得先導化合物的關鍵。目前認為,僅10%左右的人類蛋白靶點具有成藥性,因此開始藥物研發之前對靶點的成藥性進行評估是非常重要的。一般而言,對于一個新的靶點,人們通過對已知藥物靶點的序列和結構的同源性分析來預測其成藥性。但是,這種方法具有一定的局限性。一些已經上市藥物的靶點根據傳統方法被認為是非成藥的,并且同一基因家族的不同成員的成藥性也并不相同。近年來,基于受體結構的計算方法被用來預測靶點的成藥性,如分子對接或分子動力學方法。作者建立了一套評價成藥性的方法:首先將類藥分子片段庫中的分子對接到靶點蛋白的結合位點,以獲得相應的結合構象,再對得到的結合構象進行基于能量最小化的結構優化和重新打分(MM-GB/SA方法),然后通過計算的結合能的好壞程度(通過擬合已有信息預設的能量閾值)來判斷該分子是否與靶點匹配。通過計算成功匹配片段的命中率可以定量地預測靶標蛋白的成藥性。大量的測試結果表明,該方法與基于實驗篩選的方法結果有很好的一致性,可用來區分已知的成藥和非成藥的靶點蛋白。盡管這種方法的計算量相對較大,但是它們不依賴于任何已知的訓練集,因此更適合用來評價一些新的靶點。3.2“分子對接”學說目前主流的分子對接軟件,都將蛋白質近似為剛性模型,不搜索蛋白質的構象變化,只對配體分子的平動和轉動自由度進行采樣。然而受體蛋白在結合配體前后,通常都會發生不同程度的構象變化,如殘基側鏈的旋轉、環的移動,甚至是結構域的挪動。對于受體柔性對接的策略主要有兩種:(1)在分子對接前,預先生成一系列的蛋白質構象,配體分子對接到綜合后的蛋白質構象或者依次對接到每一個蛋白質構象。基于這種“構象選擇”學說,Knegtel等發展了“構象綜合體對接”(ensembledocking)的方法。基于能量的權重或者幾何權重,將蛋白質多個不同構象綜合為一個構象綜合體,這些不同構象可以是已經解析的晶體結構,也可以通過計算化學方法生成,然后利用這個蛋白質構象綜合體進行分子對接。構象綜合體包含蛋白質的構象變化信息,從而在分子對接中可以整合蛋白質柔性信息。(2)在分子對接過程中,受體在配體不同的結合模式的影響下,誘導出不同結合構象,其理論基礎是“誘導契合”學說。Sherman等發展了一套“柔性對接方法”(inducedfitdocking,IFD),這種方法首先需要人為指定結合位點的柔性殘基,然后將這些殘基突變為丙氨酸,接著利用剛性對接將配體分子對接到突變的結合位點中,然后再將突變殘基變回原來的殘基類型,并在得到的蛋白質配體復合物中,搜索配體結合位點這些柔性殘基的側鏈構象,同時允許殘基主鏈也有一定程度的變化;最后再將配體小分子剛性對接到上一步構象搜索能量優化的蛋白質中。通過多次迭代,最終得到最優的蛋白質配體復合物構象。在11個不同蛋白上進行對接測試,其中18個對接都能有效重現配體的晶體結合構象,RMSD值≤0.18nm,而剛性對接的平均RMSD值為0.55nm。3.3分子模擬預測酶活性位點在蛋白質晶體結構數據庫中,超過75%的配體-受體復合物在其結合腔穴中存在重要的結晶水。這些結合位點穩定存在的水分子,對配體-受體的結合動力學及結合熱力學都起到了重要的影響。合理設計的取代基可以取代蛋白結合位點穩定存在的水分子來增加系統的熵,從而有利于配體的結合,是藥物化學中常用的策略。一個典型實例是設計小柱孢酮脫水酶(scytalonedehydratase)抑制劑。對先導化合物14進行細微結構改造得到的化合物15以及化合物16對酶抑制活性分別提高了600和20000倍。通過分子模擬預測,在小柱孢酮脫水酶的活性位點存在結構水(圖7A),在與化合物14形成的復合物中,這個水分子不能與周圍環境形成較好的相互作用;將R處的CH基團改變為氮雜原子之后(化合物15),可以作為氫鍵受體穩定這個水分子(圖7B);而進一步將R處CH修飾為C-CN基團后(化合物16),氰基上的氮原子將結構水擠走,并與此處兩個酪氨酸側鏈形成氫鍵相互作用(圖7C)。2007年,Abel等提出了利用分子模擬來研究受體活性位點水分子性質的方法(WaterMap),這一方法使用聚簇算法分析在分子模擬過程中水分子的分布,并計算相應水分子與周圍環境的相互作用能,水分子的熵的計算則使用非均相流體溶劑理論(IFST)。利用WaterMap計算得到的水分子結構及能量信息被應用到多個藥物靶標的小分子抑制劑的研究中,包括FXa和激酶。然而這類方法需要大量計算資源,很難直接應用于分子對接計算中,因此需要發展新的算法在分子對接過程中高效并且準確考慮水分子的貢獻。2006年,Huang和Shoichet將晶體結構中蛋白活性位點的水分子加入到分子對接中,對同一個配體結合構象,周圍的水分子與之形成合適的相互作用則予以保留,不合適者予以排除使用這種算法考慮水分子之后,分子對接軟件對于陽性化合物的富集率有所提高。3.4配體分子型熵變眾所周知,配體小分子和蛋白質的結合會限制其活動,造成構型熵的損失,進而降低結合親和性。然而,基于物理的打分函數大多忽略了熵的貢獻,一些基于經驗的打分函數雖包括了熵的罰分這一項,但其背后的物理學意義并不明確,其合理性也很難驗證。盡管相關運動可能導致非累加效應,大多數打分函數仍然假設配體的熵變和配體分子旋轉單鍵的數目相關。然而,Gilson研究組在分析HIV蛋白酶和藥物Amprenavir結合過程熵的變化時發現,配體分子構型熵的丟失相當可觀,甚至高達25kcal·mol-1。更為重要的是,熵變絕大部分來自于配體和自由狀態相比,處于結合狀態下能井變窄,而非傳統認為的可及性旋轉鍵數目的減少。這一研究表明在設計配體化合物時,可以通過合理增加小分子的構象約束來實現對結合親和性的貢獻,從而為基于結構的藥物設計提供指導。雖然該工作揭示出配體分子旋轉、平移和內部自由度之間的偶合使得很難把熵變分解成幾個相互獨立、可以累加的項,但也揭示了熵效應的本質,為今后發展更為嚴格的評價函數指明了方向。3.5dud基準數據集分子對接方法雖然在近年來取得較大進展,但如何系統、客觀地評價各種對接技術就成為亟待解決的問題,其中一個關鍵指標是配體分子在誘餌分子中的富集率。由于配體分子和誘餌分子的關系對于評價分子對接至關重要,一個好的基準數據集應符合以下幾個要求:(1)數據集涵蓋數目眾多、類型廣泛、結構迥異的受體和配體分子(包括誘餌分子);(2)誘餌分子應具有和配體分子相同或相似的物理性質;(3)數據集的信息要面向公眾,可無條件免費獲得。DUD(DirectoryofUsefulDecoys)基準數據集就是在這樣的背景下應運而生的。它包含了40個不同靶蛋白的2950個已知的配體分子,每個配體又配有相應的36個誘餌分子,這些誘餌分子具有和配體相似的物理性質和截然不同的拓撲結構。研究表明,DUD數據集的偏向性較小,適合對各種對接方法進行系統的、定性和定量的評估。最近,該數據集在原來的基礎上又得到了改進和發展(DUD-E),主要包括:擴大了靶點的數量,如新添加了GPCR和離子通道等熱門藥物靶點,以及隨之擴大的配體和誘餌分子的數目,更加嚴格、自動化地評價和挑選數據集的化學類型多樣性等。3.6重標回復合成的結構優化基于分子對接技術的虛擬篩選可以從大量的化合物數據庫中快速挑選出候選化合物,而現有對接技術由于計算模型的簡化和打分函數的近似,很難保證計算結果的準確性。另一方面,如果在對接過程中考慮更為復雜的、對結合至關重要的能量因素時,計算的成本就會大大增加。因此,作者結合實際應用開發了一套兼顧計算效率和預測準確度的計算篩選方法。簡單來說,這種方法通過整合不同復雜度的物理模型和不同精度的計算方法,達到對龐大化合物數據庫分層次、逐級別的虛擬篩選(圖8)。具體來講可分為三個階段:(1)先對包含有數百萬個結構迥異的化合物數據庫進行快速的對接計算(DOCK3.5.54軟件),對每一個化合物分子在結合口袋內生成多個可能的結合模式,再運用簡化、近似的打分函數(只考慮范德華、靜電相互作用和配體溶劑化能修正項)對每一個結合模式進行初步評估,去除具有明顯空間位阻和較差相互作用的化合物;(2)對于第一步產生的結果,用基于結構最小化的MM/GB-SA方法(PLOP軟件)進行結構優化和重新打分,重打分過程中增加了體系去溶劑化能和分子內作用能的貢獻,除去結合焓較差的分子(包括同一分子較差的結合模式),同時在優化過程中可以根據需要考慮受體柔性;(3)對于第二步產生的結果,用基于分子動力學模擬采樣的MM/PB-SA方法(AMBER軟件)計算的結合自由能不僅包括上述的焓變,還可包括體系的熵貢獻。在采樣過程中,采取“聚焦結合位點”的策略來提高計算效率、增加計算的準確度:先用適當尺度的限制性水球包裹結合口袋和配體分子,對結合口袋內的受體殘基、配體分子和溶劑分子進行完全自由的動力學模擬,而對結合口袋外的殘基和溶劑分子則采取固定的模式。這種策略不僅可以節省計算成本、提高效率,還可以在有限的模擬時間(例如5ns)內對結合位點進行更廣泛的采樣。在計算自由能時,從動力學模擬軌跡中選擇達到相對平衡狀態的部分,從中平均挑選映射組成系綜,再求得有統計力學意義上的能量均值。這種逐級篩選方法在本課題組實驗室的具體應用中取得了成功。具體實例包括多個老靶點、新先導分子的虛擬篩選;以及全新靶點的全新先導化合物的搜尋。在此以尋找作用于微管蛋白秋水仙堿結合位點的新結構類型抑制劑為例來說明。已知的作用秋水仙堿位點的微管拮抗劑大多依賴秋水仙堿的藥效團模型,無論在結構還是作用模式上都缺乏新穎性。最近發表的微管蛋白復合物晶體結構揭示出秋水仙堿結合位點新的結構特征:由抑制劑分子NSC613863占據的空間拓展了傳統意義上的秋水仙堿結合位點。這個更靠近蛋白質內部的結合腔穴無論從形狀還是化學環境都與秋水仙堿口袋不同,因此針對這一結合腔穴對包含超過十萬個類藥化合物分子的商業數據庫進行了快速對接,產生了30多萬個不同的結合模式。運用從已有復合物晶體結構中總結的藥效團模型從中篩選出2萬多個結合模式進行結構優化。經過重新打分和藥效團篩選將候選分子的數目減少到1000多個。在保留了每個分子的最優結合模式后,用基于分子動力學模擬的MM/PB-SA精確地計算了結合自由能,最終產生了63個候選化合物。其中超過15個化合物都具有噻吩母核結構,挑選了9個結合模式相似的分子進行了實驗驗證,5個化合物顯示出了明顯的抑制活性,成為新一類的抗微管抑制劑分子17(圖9)。整個虛擬篩選過程盡可能減少了人為干預,實現了效率與精度的并存。所得到的先導化合物不僅具有結構新穎、易于改造的優點,還比秋水仙堿的配體效用(ligandefficiency)更高(是秋水仙堿的1.2倍)。4基于結構優化的組合篩選隨著計算化學理論與方法的不斷發展和提高,其在藥物分子設計中的作用會越來越重要,尤其是一些需要理論和實驗密切配合的前沿領域的研究,如多靶點藥物設計、藥物的選擇性等,將會把計算化學在SBDD中的應用帶到新的高度。近年來,臨床研究發現基于單個靶點設計的小分子藥物經常不適用于一些復雜疾病(諸如癌癥、糖尿病、神經性疾病等),而臨床上的一些效果好的藥物通常是偶然