不同提取方法提取菊花總糖的比較研究

氨基化合物是自然界最常見的有機化合物。它不僅是植物組織的主要成分，也是人類和動物最重要的食物來源。與沉積物、蛋白質和養分一起形成生命的分子基礎。多糖作為一種“生物應答效應物”,具有非常重要的生理活性。菊花多糖自古就可作為一種中草藥,被用來防治感冒、菌痢、腸炎、便秘、冠心病、高血壓等多種疾病,現代藥理研究表明菊花多糖是一種良好的氧自由基清除劑,具有良好的預防保健作用。常用的菊花多糖的提取方法多采用熱水提取法,張桂青等討論了常規條件下熱水浸提菊花多糖的最佳工藝條件。隨著現代技術的發展,超聲波和微波技術的應用也逐漸滲透到植物有效成分的提取領域。超聲波法提取糖類化合物的主要原理是由于超聲波產生的空化效應能產生強大的沖擊波,促使細胞內含物釋放到溶劑中,從而加速了細胞內多糖的萃取過程。微波提取的作用原理是利用空間電場和磁場的高頻振蕩,加速被提取組分向提取溶劑界面的擴散速率,從而提高提取效率。張海艷等采用微波提取海帶多糖,提高了提取率,降低了成本。唐娟等研究了超聲波協同纖維素酶提取黑木耳多糖的方法,得出了超聲波提取木耳多糖的最佳工藝。但將超聲波和微波應用于菊花總糖提取的研究較少,我們在前人研究的基礎上,運用超聲波、微波、常規熱水提取3種手段,并采取不同的工藝組合方法,提取菊花總糖。通過比較其得率大小,建立了菊花總糖的最佳提取工藝,為菊花糖類化合物的進一步純化和精制打下基礎。1材料和方法1.1實驗原材料菊花,購自北京林業大學科技有限公司。將菊花烘干、粉碎,作為菊花總糖提取實驗材料。1.2主試劑濃硫酸、苯酚、葡萄糖、α-萘酚、氫氧化鈉、硫酸銅,酒石酸鉀鈉,所用試劑均為分析純。1.3超聲波發生器和循環水生物污染721可見分光光度計(上海第三分析儀器廠);WP700(MS-2089T)微波爐(樂金電子(天津)電器有限公司);KQ-500B超聲波發生器(江蘇省昆山市電山湖鎮);AR2140分析天平(美國Ohaus公司);SHB-循環水多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);800B離心機(上海安亭科學儀器廠);恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)。1.4菊花總糖提取菊花總糖粗提液的制備:稱取粉碎的菊花干粉15份(分為5組,每組3份,每份5g)作為提取樣品。分別用熱水提取法、超聲波法、微波法、超聲波預處理-熱水提取法和超聲波-微波聯用法提取菊花總糖。將每份總糖粗提液分別離心,抽濾,濃縮至60mL備用。1.5測定了菊花總糖含量1.5.1濃硫酸溶液的制備精確稱取干燥至恒定質量的葡萄糖5mg,置于100mL容量瓶中,定容,搖勻。準確從中分別吸取0.3,0.6,0.9,1.2,1.5,1.8mL分置于6個25mL容量瓶中定容,獲得6個梯度濃度標準溶液。從中各吸取2.0mL標準溶液(2.0mL蒸餾水做空白),加入5%苯酚1.0mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0mL,搖勻置沸水浴15min,冷水中冷卻30min至室溫,于490nm波長處測定其吸光度。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線。標準曲線吸光度值如表1。1.5.2濃硫酸與糖溶液的分離取5種菊花總糖粗提液各1mL,置于5支試管中,每管均加入5滴α-萘酚溶液,混勻。分別沿管壁慢慢加入濃硫酸1mL,使濃硫酸與糖溶液清楚的分為兩層,觀察兩液面間的變化。取5只試管分別加入濃度為1.25mol/L的氫氧化鈉溶液(溶有濃度為0.6mol/L酒石酸鉀鈉)和濃度為0.14mo/L的硫酸銅溶液各1mL,混勻,再分別加入0.5mL粗提液,搖勻,沸水浴3min,觀察溶液顏色變化。1.5.3濃硫酸-苯酚分光光度法精確量取上述各濃縮液0.5mL,定容于100mL容量瓶中,作為樣品供試液。精確吸取各樣品供試液2mL,分別置于5支試管中(蒸餾水做空白),加入5%苯酚1.0mL,搖勻,迅速滴加濃硫酸5.0mL,搖勻置沸水浴15min,冷水中冷卻30min至室溫,于490nm波長處測定其吸光度。1.5.4穩定性試驗取樣品供試液,按照“1.5.3”測定方法,將同一份反應液間隔一定的時間,測定吸光度值。1.5.5提取液濃度的測定總糖得率=C·W·V/M,其中:C為溶液濃度(單位:mg/mL),W為稀釋倍數,V為提取液的體積(單位:mL),M為稱取固體菊花干粉的質量(單位:g)。1.5.6數據的統計分析采用SAS軟件,對5種方法的提取率進行統計分析。2結果與分析2.1時域方程介紹根據“1.5.1”的方法繪制標準曲線,得出曲線方程如圖1。以溶液濃度(C)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標繪制標準曲線,得出曲線方程為:A=12.74C+0.025(R2=0.997)2.2突出保護羧酸系統中的氧化酶對各種粗提液進行糖類化合物鑒定,在提取液與濃硫酸的界面均出現紫色環,說明提取液中含有糖類化合物;而且各個樣品溶液與氫氧化鈉溶液和硫酸銅溶液反應,均有磚紅色沉淀產生,說明提取液中含有還原性糖。2.3菊花總糖提取率測定取備好的菊花干粉3份(每份5g),置于3個燒瓶中,分別加入125mL水,85℃下,恒溫水浴鍋中回流提取2.5h,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進行吸光度值測定,記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。計算總糖得率,其結果如表2。由表2可知,在上述實驗條件下,熱水法提取菊花總糖的得率是7.92%。2.4超聲法提取菊花總糖的效果取菊花干粉3份(每份5g),置于3只錐形瓶里,分別加水125mL,設定超聲波功率500W,在60℃溫度下間歇提取兩次,每次15min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進行吸光度值測定,記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結果如表3。由表3可知,在上述實驗條件下超聲波法提取菊花總糖的得率是6.94%,比常規熱水法的提取率低0.98%。原因可能是用超聲波提取時,提取溫度為60℃,這個溫度低于熱水提取法的提取溫度85℃,菊花總糖未能充分溶解在溶劑中,從而導致提取率較低。2.5微波法提取總糖的最佳時間取菊花干粉3份(每份5g),置于3只燒杯中,分別加水125mL,設定微波輸出功率700W,置于解凍檔間歇提取3次,每次2min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進行吸光度值測定,分別記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結果如表4。由表4可以看出,在上述實驗條件下,微波法提取總糖的得率是7.33%,比常規熱水法的提取率低0.59%。原因可能是由于植物結合水汽化溫度比較高,致使小部分糖分子焦化,從而導致提取率略低。但是兩者的提取率相差并不是很大。但是在試驗的過程中,用微波提取時,如果微波加熱時間控制不好,容易產生暴沸現象。在這種情況下就會導致物料損失,降低提取率,且操作安全性比較低。2.6超聲-熱水提取法和微波-微波聯用法提取菊花總糖的比較取菊花干粉3份(每份5g),置于3只錐形瓶中,分別加入125mL水,在超聲波功率500W,溫度60℃的實驗條件下間歇提取30min后轉移至燒瓶中,85℃下熱水回流提取30min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進行吸光度值測定,分別記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結果如表5。由表5可知,在上述實驗條件下,超聲波預處理-熱水提取法提取菊花總糖得率達到9.86%,比常規熱水法的提取率高1.94%。原因可能是提取物先在超聲波作用下,使細胞破碎完全;再在85℃熱水中浸提,使糖類比較充分的溶解到提取劑中,從而使得率提高。該提取方法縮短了提取時間,提高了提取效率。取菊花干粉3份(每份5g),置于3只錐形瓶中,在超聲波功率500W,60℃條件下,超聲波法間歇提取30min后,再用微波間歇提取3次,每次2min,得菊花總糖粗提液。對每份粗提液分別進行吸光度值測定,記作Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,計算總糖得率,其結果如表6。由表6可以看出,在上述實驗條件下,超聲波-微波聯用法提取菊花總糖的得率為8.98%,比常規熱水法提取率高1.06%。但是,在試驗的過程中卻發現:使用超聲波-微波聯用法提取菊花總糖時,提取液黏度比較高。可能是因為兩者同時作用,促使其他細胞內容物連同糖類物質一起釋放到溶劑中,致使提取液黏稠度增高,使分離操作的難度增加,不利于總糖的進一步分離純化。2.7波后提取率測定在試驗的過程中,對每份粗提液進行吸光度值測定時,每隔10min讀取一次吸光度值,連續測4次,實驗結果穩定。使用SAS軟件對5組數據進行分析,結果如表7。以常規熱水處理組做對照,由表7可以看出:超聲波處理組、微波處理組與常規熱水處理組相比較,提取率差異不顯著(p<0.05)。超聲波預處理-熱水處理組、超聲波-微波處理組與常規熱水處理組相比,結果差異顯著(p<0.05),提取率大于常規水提組。3超聲-微波法提取菊花多糖的最佳提取方法實驗結果顯示,用5種方法提取菊花總糖時,超聲波法、微波法的提取率與常規水提法相比,差異不是很大;而超聲波預處理-熱水提取法、超聲波-微波聯用法的提取率明顯高于常規熱水法的提取率。但是使用超聲波-微波法提取菊花多糖時,會造成提取液黏稠度增高,不利于下一步的分離純化。綜合各方面