微量量熱法研究麻黃湯與麻杏石甘湯的生物熱力學對比

麻黃湯和麻杏石甘湯是著名的中醫方劑，均源于漢代張仲景的“傷寒論”。其中,麻黃湯由麻黃、桂枝、杏仁、甘草4味中藥組成,具有辛溫解表,宣肺平喘的功效,主治太陽傷寒表實證;麻杏石甘湯由麻黃、杏仁、石膏、甘草組成,具有辛涼解表、宣肺平喘之功效,主治肺熱咳喘癥。二藥僅一味之變而致全方寒熱藥性發生改變。為了探討二藥藥性改變的客觀依據,本研究選取麻黃湯和麻杏石甘湯作為研究對象,以金黃色葡萄球菌作為生物模型,采用生物熱力學的主要研究方法-微量量熱法研究了藥物對金黃色葡萄球菌的代謝影響,通過測定其藥液對細菌代謝的熱功率-時間(P-t)曲線,得到了受試菌代謝的生長速率常數、最大發熱功率等一系列熱動力學參數,由此分析麻黃湯和麻杏石甘湯的藥性差異,并探討其藥性的客觀真實性。1材料表面1.1熱活性的測定采用瑞典Thermometric公司產TAMAirIsothermalCalorimeter測定。該熱活性檢測儀配置PicoTC-80數據采集和分析軟件。實驗時系統控溫于37℃。1.2中國培養物保藏中心金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(CCTCCAB910393)由武漢大學中國典型培養物保藏中心提供;培養基采用LB液體培養基,取NaCl5g,酵母膏5g,蛋白胨10g,溶解于1000mL蒸餾水中,調pH至7.0~7.2后分裝。121℃高壓蒸氣滅菌30min,冷卻后放置冰箱中備用。1.3試劑的制備方法麻黃、桂枝、杏仁、甘草及石膏藥材均由解放軍第302醫院中藥房提供,并經肖小河研究員鑒定符合《中國藥典》2005年版規定。所有試劑均為分析純。麻黃湯和麻杏石甘湯水煎劑的制備:按配伍比例,分別稱取麻黃湯和麻杏石甘湯,10倍水浸泡30min,煎煮1h,共煎2次,合并濾液,濃縮干燥得浸膏,4℃冰箱保存備用。測定時以無菌水制成每毫升相當于原生藥1g的混懸液,得初始藥液質量濃度為1g·mL-1。2熱功率-時間曲線法本實驗采用安瓿法,采用無菌操作將金黃色葡萄球菌接種于100mL培養基中,菌接種量為1×106個/mL,搖勻后向每個安瓿瓶中精確加入10mL細菌培養基溶液,然后加入一定量藥液,加蓋瓶塞,密封后放入微量量熱儀中跟蹤記錄金黃色葡萄球菌生長代謝過程熱功率-時間曲線(P-t圖),當曲線重新返回基線時,實驗結束。3結果3.1生長代謝產熱曲線測定在37℃下,采用安瓿法測定了金黃色葡萄球菌生長代謝產熱曲線,同時測定了其在麻黃湯和麻杏石甘湯藥物作用下的生長代謝產熱曲線(圖1,2)。在相同的實驗條件下,實驗結果有良好的重現性。3.2細菌指數調空的動力學模型由于安瓿瓶中特殊生長環境,細菌的整個生長過程處于恒溫恒壓的條件下,養分和氧氣的供應量有限。然而,在運用微量量熱技術研究細菌的生長動力學時發現,在新鮮培養基中,當接種量很小時,在生長初期,能近似滿足無限制生長條件,熱曲線呈現出指數生長特征。據此,在分析細菌指數生長期熱曲線的基礎上,建立了細菌生長的熱動力學模型,即在細菌細胞的生長過程中,其指數生長期內的產熱功率與培養時間之間符合公式:Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+ktP0和Pt分別是細菌的指數生長的初始點和t時的熱功率,將熱譜曲線上的指數生長期的Pt,t值代入公式中,用計算機進行線性擬合可以得到金黃色葡萄球菌的生長速率常數(k)值(見表1),以及在不同濃度藥物作用下的生長速率常數(見表2)。由表1可得k=(0.02526±0.000402)min-1,相關系數R均大于0.9950,可見其結果有很好的重現性和相關性。同時由tG=In2/k,可求得不同條件下的細菌傳代時間。金黃色葡萄球菌在不同濃度藥物作用下的生長速率常數、傳代時間tG和生長期的最大發熱功率Pmax及出峰時間tp如表2所示。3.3藥物作用下的抑制率細菌生長抑制率I(%)=[(k1-k2)/k1]×100%,式中k1為對照組細菌的生長速率常數,k2為細菌受到藥物抑制時的生長速率常數;當抑制率為50%時所對應的藥物濃度為半抑制濃度IC50。根據以上定義,計算了金黃色葡萄球菌在不同濃度的藥物作用下的抑制率(I),其結果如表2所示。同時根據以上定義,由表2可見,麻黃湯對金黃色葡萄球菌的半抑制濃度為33.4mg·mL-1,而麻杏石甘湯對金黃色葡萄球菌的半抑制濃度降低為25.3mg·mL-1。3.4麻黃湯k-c線性回歸模型由表2可見,麻黃湯與麻杏石甘湯作用于金黃色葡萄球菌,隨藥物濃度的增加,金黃色葡萄球菌的生長均受到抑制,指數生長期的k減小。將k對C作線性回歸(見圖3),并用計算機對k-C數據進行線性擬合,得到k與C之間的關系式分別為:麻黃湯k=-0.0004C+0.026,r=0.9961;麻杏石甘湯k=-0.0005C+0.0253,r=0.9880。3.5功率pmisa影響由表2可見,隨著藥物濃度的增加,金黃色葡萄球菌的傳代時間tG增加,生長期的最大發熱功率Pmax隨之減小。以Pmax對k進行線性擬合(見圖4),Pmax與k呈正相關,Pmax與k的關系式分別為:麻黃湯Pmax=31211k-62.161,r=0.9992;麻杏石甘湯Pmax=26154k+24.78,r=0.9779。4不同藥物作用的分離效果細菌生長速率常數k值是表征細菌生長代謝過程的特征常數之一,在條件相同而加入不同抑制性藥物或改變藥物的濃度時,k值的改變可作為評價藥物抑菌效果大小的參數。本研究表明,麻黃湯與麻杏石甘湯均能不同程度地抑制金黃色葡萄球菌的生長,且隨著藥液濃度的增加,其抑菌作用逐漸增強。其中,溫熱藥方麻黃湯較寒涼藥方麻杏石甘湯對金黃色葡萄球菌的抑制作用相對弱,具體表現為麻黃湯作用于金黃色葡萄球菌時,其指數生長期生長速率常數降低幅度小,傳代時間延長少,最大產熱功率較大;而麻杏石甘湯作用于金黃色葡萄球菌時,其指數生長期生長速率常數降低幅度大,傳代時間延長多,最大產熱功率較小,表明兩者存在較穩定的差異。同時,本研究還表明,麻黃湯較麻杏石甘湯對金黃色葡萄球菌生長代謝的熱輸出相對較高,說明二者的藥性差異是客觀存在的,這與有關寒熱藥性研究的文獻報道相吻合,即溫熱藥可提高機體神經