參苓白術散對潰瘍性結腸炎小鼠腸道調節性細胞免疫調節作用及機制研究

潰瘍性胃炎（iu）是一種非特異性炎癥。目前,UC病因及發病機制不十分明確,臨床常用糖皮質激素和5-氨基水楊酸類藥物治療潰瘍性結腸炎,但此類藥物存在嚴重副作用。新近研究發現,CD4+CD25+T細胞(regulatoryTcell,Treg)在機體的免疫調節中具有重要作用,其數量缺乏或功能缺陷可直接引起人和動物多種自身免疫性疾病。據報道,參苓白術散以其有效的治療效果和較少的副作用被廣泛應用于潰瘍性結腸炎的治療,然而目前對于其具體機制的研究并不明了。本實驗建立TNBS誘導小鼠結腸炎模型,應用參苓白術散進行治療,揭示Treg在UC小鼠腸道中的變化規律,探索參苓白術散對UC的作用機制。1材料和方法1.1實驗動物中心昆明小鼠,雄性,60只,體質量18~22g,由河北省實驗動物中心提供。動物許可證編號為SCXK(冀)2008-1-003。1.2tnbs和t-對p3抗體檢測參苓白術散購于山西華康藥業股份有限公司,國藥準字Z14020346。地塞米松購于武漢遠大制藥集團有限公司。TNBS購于Sigma公司;大鼠抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25、AlexaFluor(2)488-Foxp3抗體,Biolegend公司產品;Foxp3固定破膜試劑盒,eBioseienee公司產品。1.3小鼠腸道調節性t細胞比例的檢測實驗分為正常對照組,TNBS模型組,參苓白術散高劑量組,參苓白術散中劑量組,參苓白術散低劑量組,地塞米松組。每組10只。除正常對照組外,乙醚麻醉小鼠,用直徑為1mm的聚乙烯導管從肛門插入腸道約3cm,緩慢注入TNBS/乙醇溶液0.1mL(3mg/mL,40%乙醇)。小鼠被倒置1min以確保TNBS/乙醇溶液能在腸道均勻分布。給藥后6h,正常對照組和TN-BS模型組灌胃0.2mL生理鹽水,每天1次;地塞米松組在造模后1、3、5、7、9d給予地塞米松(1mg/kg,皮下注射),參苓白術散溶解于生理鹽水中,參苓白術散低、中、高劑量組按照0.2mL藥液體積灌胃,藥物質量濃度分別為140、280、560mg/mL。連續用藥10d,造模第11天,處死小鼠。在冰浴條件下取結腸,測定結腸長度;取腸系膜淋巴結,測定調節性T細胞比例;結腸液氮速凍后轉入-80℃保存,以備檢測結腸勻漿細胞因子水平。1.4測量的長度1.5熒光標記巖石細胞的制備取小鼠腸系膜淋巴結,PBS緩沖液沖洗兩遍,5mL注射器針芯研磨腸系膜淋巴結,300目尼龍布過濾,260×g離心5min收集細胞。調整腸系膜淋巴細胞密度為5×106個/mL,取出100μL,在每個流式上樣管中加入100μL準備好的細胞懸液,細胞數約為5×105個。標記抗小鼠PE/Cy5-CD4、PE-CD25抗體,避光4℃孵育30min。用預冷的PBS洗滌細胞,旋渦震蕩重懸細胞后加入1mL的固定/破膜工作液并再次旋渦混勻,避光4℃孵育30min。加入2mL破膜緩沖工作液離心洗滌細胞并棄去上清液,直接加入稀釋好的熒光標記Foxp3抗體5μL,避光4℃孵育30min,加入4mL破膜緩沖工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。0.5mLPBS重懸細胞,上機檢測并分析。1.6elisa法測定各組小鼠腸道組織勻漿水平磷酸鈉緩沖液清洗結腸,處理后的結腸15000×g離心30min,收集上清,ELISA法測定腸組織勻漿上清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。2統計學分析實驗結果皆以ue0af±s表示,采用SPSS15.0統計軟件包進行統計學分析。采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較,采用最小顯著差法檢驗,P<0.05為差異有顯著性。3結果3.1各組小鼠結腸長度的比較與TNBS模型組比較,參苓白術散中劑量組能明顯增加潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度(P<0.05),參苓白術散高劑量組及地塞米松組能顯著升高小鼠結腸長度(P<0.01)(如表1)。此組數據顯示了參苓白術散高劑量組在減輕潰瘍性結腸炎病變程度的潛在作用。3.2各組大鼠腸道il-1、f-和tnf-表達水平的比較為檢測參苓白術散能否通過降低腸道炎性細胞因子表達發揮腸黏膜保護作用,本實驗檢測腸道TNF-α和IL-1β水平,如表2所示,與模型組比較,參苓白術散高劑量組與地塞米松組能顯著降低腸道IL-1β水平(P<0.01),參苓白術散高劑量組能顯著降低腸道TNF-α表達(P<0.05)。提示參苓白術散可能通過降低腸道炎性細胞因子分泌減輕腸道損傷。3.3參茯苓白術散對小鼠腸道il-10、tgf-的影響有研究報道潰瘍性結腸炎發病與免疫抑制性細胞因子IL-10和轉化生長因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)降低有關,CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞通過產生IL-10和TGF-β減輕腸道炎癥狀態。因此,在這部分實驗中,探索了參苓白術散治療是否可以上調結腸組織勻漿中IL-10水平,是否可同時升高腸系膜淋巴結Treg細胞的比例。如表3所示,與正常對照組比較,TNBS模型組小鼠IL-10明顯降低,而與模型組比較,參苓白術散高劑量組顯著升高了腸道IL-10水平(P<0.01)。為探求參苓白術散是否通過調節Treg細胞的比例發揮治療效應,我們檢測了腸系膜淋巴結淋巴細胞CD4+CD25+Foxp3+T細胞與CD4+T比值。結果顯示與模型組比較,參苓白術散高劑量組明顯提高腸系膜CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+T數值,見表3。4參茯苓白術散對資金供應的調節作用參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》,被廣泛應用于胃腸道疾病的治療。雖然參苓白術散多年來應用于潰瘍性結腸炎,但其具體機制仍不明了。一些研究認為其治療作用與提高大鼠結腸組織SOD活性,降低MDA水平、降低結腸炎大鼠吞噬細胞膜糖蛋白及可溶性黏附分子P選擇素有關。然而,參苓白術散與潰瘍性結腸炎腸道調節性T細胞的關系尚未明了。本研究建立TNBS誘導小鼠結腸炎模型,應用參苓白術散進行治療,研究顯示參苓白術散高劑量組通過減輕TNBS誘導潰瘍性結腸炎結腸長度縮短、降低腸黏膜炎性細胞因子表達、直接影響腸系膜Treg細胞比例與功能,調節腸道高炎癥狀態。IL-1β是炎性腸病進展的重要介質。IL-1β一方面作為抗炎因子介導UC急性期過程,在UC發生的初始階段發揮重要活性,另一方面,它還可反饋性的促進巨噬細胞和T淋巴細胞產生IL-2,IFN-γ加速炎癥反應。TNF-α主要由活化的單核巨噬細胞所產生,可使白細胞在炎癥局部聚集,刺激單核細胞、血管內皮細胞等產生細胞因子,最終導致組織的損傷,在UC中被公認為是一種促炎細胞因子。在UC活動期,TNF-α水平升高能介導腸黏膜損傷作用。本實驗中,潰瘍性結腸炎小鼠腸道TNF-α與IL-1β水平均升高,增高的細胞因子與炎癥細胞相互作用,加重局部腸黏膜的炎癥損傷。經過參苓白術散治療,減輕了TNF-α、IL-1β與炎癥細胞相互作用,減輕局部腸黏膜的炎癥損傷,從而促進腸黏膜修復與潰瘍愈合。CD4+CD25+Treg對潰瘍性結腸炎有預防和治療作用,其功能異常或數量減少均可導致自身免疫性疾病發生。有效升高Treg比例和加強其功能已經成為結腸炎免疫治療的新策略。實驗結果顯示參苓白術散高劑量組明顯升高腸系膜淋巴結Treg細胞比例,說明參苓白術散可能通過提高腸道Treg數量發揮腸道黏膜保護作用。調節性Treg主要通過分泌IL-10和TGF-β發揮免疫調節作用。研究表明,由Treg誘導的IL-10升高是結腸炎治療的有效手段。本實驗研究結果顯示,與正常組比較,TNBS模型組小鼠腸道IL-10水平明顯降低,其趨勢與Treg細胞一致,經參苓白術散治療后,腸道IL-10水平水平顯著提高。進一步加強了參苓白術散通過調節腸道黏膜Treg及相關細胞因子IL-10發揮黏膜保護作用的假設。同時,這也解釋了為