植物植物非寄主抗性

1非寄主植物基因突變體hrp基因的表達通過共同的發展，只有少數微生物在一定植物中建立了生態位。慶幸的是,這一致病生態位通常情況下在相同的植物種類上,并不適合大多數的微生物。從這一意義出發,就可以說這一植物對這些不能成功侵染的微生物表達了非寄主抗性(nonhostresistance),這也屬非親和互作類型。這種類型在自然界廣泛存在。抗性在植物中是普遍現象,感病僅是例外。另一方面,微生物從腐生、寄生向共生方向進化,能夠致病的病原物僅是少數。人工接種一種植物上的病原物至另一非寄主植物上,或一感病品種上的病原物至另一抗病品種上,常可見過敏性反應(hypersensitiveresponse,HR)。這種現象最早在Ward(1902)研究的雀麥冠銹病(Pucciniadispersa)中就發現了。二十世紀30～50年代,人們在研究病毒鑒別寄主和研究專性寄生菌致病性分化的鑒別品種上發現有枯斑反應(necrosisresponse)。1964年,Klement等人發現革蘭氏陰性植物病原細菌在非寄主植物上有過敏性反應。70～80年代,Kuc等人提出ISR(Inducedsystemicresistance),現稱為系統獲得抗性(SAR,Systemicacquiredresistance)。1984年,Callow在描述植物——微生物互作發育關系時首次闡述植物和病原物在物種水平上的不親和性為非寄主抗性,并指出非寄主抗性是由病原物產生的激發子與非寄主感受蛋白識別后激發產生誘導抗性的結果。1986年,Lindgren等克隆出丁香假單胞菌菜豆致病變種(Pseudomonassyringaepv.phaseolicala)的hrp基因。hrp基因突變體不能在非寄主或非親和寄主上產生HR,也不能在親和寄主植物上致病(陳功友等,2000)。1987年Boucher等報道青枯假單胞菌(P.solanacearum)的dsp(diseasespecificpathogenicity)基因表型。dsp突變體在親和的寄主植物上不致病,但在非寄主植物上可激發HR。1992年,Wei等人從梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)中分離和表達能夠激發非寄主植物——煙草產生HR的harpin蛋白激發子。Yu等人(1995)從致病疫霉(P.parastitica)中分離出引起煙草HR和誘導煙草SAR的激發子elicitin。1996年,Alfano等人明確了引起非寄主HR的harpin分子的活性片段。1997年,Kamoun證實煙草對elicitin的識別決定了其對P.infestans的非寄主抗性。Jackson等人(1999)在P.syringaepv.tomato中證實了致病島(pathogenicityisland)的存在。董漢松等人(1999)證明,非特異性激發子harpinEa誘導的SAR是由水楊酸(salicylicacid,SA)這一信號傳導途徑進行的。近幾年來,病原菌致病相關基因及其產物在非寄主植物上的作用以及在非寄主植物上引致HR和SAR過程中的識別、信號傳遞和調控防衛基因表達,成為分子生物學和分子植物病理學研究的熱點領域,與此同時,研究尋找植物抗病反應的R基因及其產物結構與功能的多樣性規律,尤其是非寄主植物抗病反應信號傳遞上游的共同機制,引起植物病理、生理和育種學家的廣泛關注。2hrp基因族一般而言,非寄主抗性主要發生在識別的早期和隨之產生的HR和/或SAR,或者非寄主抗性在非病原物(nonpathogen)或非親和病原物(imcompatiblepathogen)能否成功侵入寄主植物的決定時期得以表達。從目前已克隆的R基因來看,其產物結構多具膜蛋白性質,在識別、信號傳遞過程中起Avr受體作用。avr產物具兩種功能(bakeretal.,1997):一方面具小種-專化性負調控作用,即avr突變或失去功能,則病原物的寄主范圍擴大;另一方面,具特異性識別對應的R功能,識別后經信號傳遞,調控防衛基因表達,在非親和寄主植物上產生HR。R和avr都存在著各自的共有保守序列(commonconsensussequences)(Lindgren,1997)。hrp基因族的主要功能是編碼組成Ⅲ型分泌系統(He,1998;Galanetal.,1999),有些hrp基因產物,如harpin,可在非寄主植物上激發HR和誘導SAR(陳功友等,2001)。另外,研究表明,hrp對avr轉錄其調控作用,所有的丁香假單胞菌的avr都可能是與hrp基因協同調控的。因此,植物育種家們希望能把對一非病原物或一非親和性病原物侵染具抵抗性的非寄主抗性基因轉移至能受此病原物侵染的寄主植物上,借助HR和/或SAR機制,不受種、專化型、小種-專化性的限制而拓寬轉基因植物抗病譜。與此同時,植物病理學家們也正試圖揭示植物-非親和性病原物間互作機制,尋找病原物致病災變規律(病原物寄主范圍和致病性進化的物質基礎),把病原物致病相關基因進行改造,使之成為寄主上的非親和性病原物并發揮激發子(elicitor)的作用,誘導植物具有HR和/或SAR機制。3非寄主植物的特性毫不奇怪,作為植物病原物的微生物經進化,已能產生一些酶類來消解不同的植物成分,如角質層、胞壁、中膠層、植保素等,甚至其本身的胞質成分,或者所產生一些產物都可能有激發非寄主植物產生HR和/或SAR的能力。如果非寄主抗性因毒素而被征服或消失,或者人工熱激或用代謝抑制劑降低抗性,則許多原來不能侵入植物的非病原物就能有效侵染(Heath,1991)。這就提出一些疑問:非寄主抗性的本質是什么?這些反應是如何被信號激發的以及非寄主植物如何抑制病原物侵染的?3.1引起三性侵風險的細胞松弛素Kobayashi等人(1995)以豌豆白粉菌(Erysiphaepisi)接種大麥葉鞘細胞時發現,由于非寄主大麥葉鞘細胞中的微絲和微管在侵染位點下聚集、核移向侵染位點和原生質向侵染位點極性集中而形成乳突,因而使E.pisi不能侵入。當用具破壞微絲作用的細胞松弛素A處理大麥葉鞘細胞時,包括E.pisi在內的其它不是大麥上的病原菌,如Alternariaalternata、Colletotrichumgraminicola、Cornesporamelonis、Micosphaerellapinodes等,都能有效侵入。細胞松弛素處理的大麥、小麥、煙草和黃瓜,都能被E.pisi侵染。Gross等人(1993)也觀察到非病原菌Phytophthorainfestans在侵染大麥細胞時的類似情況發生。因此,植物細胞骨架在非寄主抗性中可能起三個作用:(1)防衛相關反應的極化作用(趨向侵入位點);(2)信號傳遞(因微絲和微管而加速信號傳遞);(3)毗鄰細胞間的信號交流(通過存在于胞間連絲中的肌動蛋白微絲(actin)起作用)。3.2rp基因和harpin蛋白的病原菌細菌最具說服力的應該是植物病原細菌的hrp基因及harpin蛋白的發現。許多革蘭氏陰性植物病原細菌在非寄主上激發HR的能力與其在寄主上引致病害的能力是相關的,即在非寄主植物上失去激發HR的突變體,在寄主植物上也失去其致病性。目前已分離和純化出hrp基因和harpin蛋白的病原細菌有(表1):梨火疫病菌E.amylovora(Weietal.,1992)、菊歐氏桿菌E.chrysanthemi(Baueretal.,1995)、胡蘿卜歐氏桿菌胡蘿卜致病變種E.carovotorapv.carovotora(Cuietal.,1996)、丁香假單胞丁香致病變種P.syringaepv.syringae(Heetal.,1993)、丁香假單胞大豆致病變種P.syringaepv.glycinea和蕃茄致病變種P.syringaepv.tomato(Prestinetal.,1995)以及水稻黃單胞菌Xanthomonasoryzae(陳功友等,2001)等。迄今為止,已在下列幾方面明確了hrp基因產物harpin分子的一些共性。3.2.1harrisin分子具有明顯的生物學功能①引致非寄主植物產生HR和②誘導植物產生SAR,③耐熱性,harpin分子經100℃處理10分鐘,誘導非寄主產生HR的能力不會喪失。3.2.2harpencc與harpiech具的相似性同一屬的病原細菌產生的harpin在核酸和蛋白質序列上同源性較高,如harpinEcc與harpinEch具72.1%的相似性、53.4%的同一性,harpinEcc和harpinEa具66.6%的相似性和50.8%的同一性,特別是靠近C端約50%的部分,具有90%以上的相似性和同一性(Bauer,1995)。3.2.3植物細胞型分泌系統已明確,avr基因轉錄取決于hrp調控系統,Avr依賴Ⅲ型分泌系統被注入植物細胞中。小種專化性的Avr-R介導的HR需功能性的hrp分泌系統,但在非寄主上的HR并不需要Avr-R的介導(Lindgren,1997)。3.2.4harpin信號傳遞從現有試驗證據可大致推測,harpin通過Ⅲ型分泌系統泌出到胞外,與植物細胞壁上的受體結合(目前未克隆到此受體),引發K+/H+的跨膜交換、活性氧迸發。大量的活性氧如H2O2,可引發植物細胞編程死亡(PCD,programmedcelldeath),表型為HR(Desikan,1998;Dongetal.,1999)。Harpin與外源的H2O2都可啟動植物細胞主動的自殺性細胞死亡,誘導植物防衛反應(defenseresponse,DR)基因表達,如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、鄰氨基苯甲酸合成酶(ASA1)等基因的表達。但是,harpin與外源過氧化氫是通過不同信號途徑誘導植物細胞編程死亡和防衛基因表達的(Desikan,1998)。Harpin可以啟動兩個不同信號傳遞途徑,一是導致活性氧產生和PAL、GSTmRNA的表達,另一個是導致GST和ASA1表達的增加。Baker等人(1997)指出,誘導表型為SAR的hapin分子,其作用機理類似于SA。現已清楚,harpin誘導的SAR是通過SA這一信號傳導途徑進行的(Dongetal.,1999)。harpin結構與功能的關系,研究報道得還不多。Alfano等人(1996)研究表明,HrpZpss的N端的153個氨基酸片段、N端109個氨基酸片段、C端216個氨基酸片段都具有引起HR的活性。據推測,harpin分子至少有四個結構域:(1)誘發HR(可能為PCD)的結構域,(2)誘導產生SAAR的結構域,(3)與Ⅲ型分泌系統互作的結構域,(4)與反應專一性有關的結構域(harpin本身不能在其寄主范圍內的植物上引起HR)。3.3非宿主抗性一種植物對非自身病原真菌的抗性雖然可以從預存性抗病機制(包括結構性的和化學性的)和主動防衛機制方面找到證據,但普遍認為,這些非寄主抗性是受誘導表達的。3.3.1植物細胞活性變化Hadwiger(1994)長期研究豌豆-茄腐鐮孢菌菜豆專化型(Fusariumsolanif.sp.phaseoli)系統中的非寄主抗性。他認為,非寄主抗性是植物細胞和外來病原物細胞間強烈的細胞不親和性(intensecellimcompatibility)造成的,保持細胞生命力(viability)是非寄主抗性的關鍵。在菜豆茄腐鐮孢菌和非寄主豌豆互作中,病原菌和豌豆細胞間的生理接觸,能使各自的水解酶類與其多聚體底物相結合,如β-葡糖酶和幾丁質酶與真菌中的β-1,3葡聚糖和幾丁質相結合,真菌的果膠水解酶與植物的果膠相結合,真菌核酸酶和蛋白酶與植物的核酸及蛋白底物相結合,隨后產生許多片段,用作信號分子。β-葡聚糖酶和幾丁質酶可直接影響真菌生長,分別消解真菌伸展菌絲頂端的葡聚糖和幾丁質胞壁多聚體,產生脫乙酰殼多糖(chitosan)。Chitosan低聚體(主要為七聚體heptamer)能在豌豆-茄腐鐮孢菌菜豆專化型互作的30分鐘內到達植物細胞核。Chitosan具有改變植物DNA構象的能力,使含有防衛基因的染色體形成loop,便于轉錄表達。Chitosan有兩種功能(Dean,1997):限制F.solanif.sp.phaseoli的萌發和生長;激發寄主反應,直接或間接改善寄主細胞活性。寄主細胞活性持續時間越長,病原菌就越能被有效抑制,這一時期積累的胼胝質、木質素、植保素等就越多。植物防衛反應蛋白的積累,包括幾丁質酶和β-葡聚糖酶,可進一步降解真菌胞壁從而釋放低聚體Chitosan。3.3.2elicidn的活性及誘導植物hr的結構域分析雖然目前還不能證明非寄主抗性中存在激發子—受體模式,但已經發現能夠在非寄主上產生HR和誘導SAR的蛋白質因子,其中疫霉屬真菌的10kD的肽類物質elicitin和糖蛋白研究得比較清楚(表1)(Perezetal.,1997)。已有12種elicitin的全序列被分析出來,它們都由98個氨基酸組成,相互間的序列同一性大于60%。初步明確,elicitin引起HR的結構域與誘導SAR的結構域在分子的不同部位,并且鑒定出與誘發HR活性關系最密切的13號氨基酸殘基。Kamoun等人(1997)證明,煙草對elicitin的識別決定了其對馬鈴薯晚疫病菌(P.infestans)的非寄主抗性。一般認為,疫霉菌的elicitin是通過結合植物細胞膜上的受體蛋白來激活信號傳遞系統,調控防衛基因表達,從而誘導植物產生SAR。從以上分析可以看出,不同病原物,在非寄主植物上引致HR和/或誘導SAR,是激發子與寄主感受蛋白識別后激發產生誘導抗性的結果。在這種情況下,病原物產生的激發子很可能是非特異性激發子,寄主的感受蛋白能接受一種或多種非特異性信號。4非病毒抗性和非親和性非寄主抗性與小種—專化性抗性和誘導抗性有關。病原物在找到致病生態位的同時,植物種借助種間雜交和隨后的選擇,通過突變、不等交換、基因漂移和基因重組等機制,抗性得到進化。單一孟德爾抗性基因R,常表現為串聯重復基因座位的特征(Hammond-Kosacketal.,1997),它能使植物對病原物種中的小種具有小種—品種專化性抗性。抗性常由寄主中單一顯性基因R和病原物中單一顯性基因avr匹配決定(基因對基因互作)。從進化角度上看,雖然病原物的avr由于具有串聯重復基因痤位的特征(Ericetal.,2000),使其致病多樣性處于主導地位,但非寄主植物對病原物的侵染的抗性卻是普遍的,特別是那些存在基因對基因關系的病原物接種到非寄主植物上,常可見非寄主抗性,表型上多為HR和/或SAR(Sequeiral,1979)。另外,遺傳上不具有病害抗性鑒別特征的植物常產生所謂誘導抗性(inducedresistance)反應。當一植物預先用一無毒性的微生物接種,就會產生對一有毒性的病原物的誘導抗性。結果,有毒性的病原物的致病過程受到阻撓。還有一類誘導抗性,即,用一親和性病原物挑戰接種,也能誘導抗性反應,它能推遲隨后接種在毗鄰葉片上相同病原物的侵染。誘導抗性還可在應用某一化合物來激發病害抗性反應的發生。誘導抗性可以應用代謝抑制劑、熱激等來干擾抗性反應過程,使非寄主抗病性的級聯反應受到阻撓(Keen,1992)。這表明,在一定情況下,如果某一植物能針對某一挑戰病原物迅速和全面地產生反應,則這一植物就具有抵抗幾乎任何病原物侵染的防衛機制。非寄主抗性主要包括預存性抗病機制和誘導性主動防衛機制。在非寄主抗性中雖然也可能存在基因對基因關系,但不會是每一種植物對每一種潛在的病原物都有一個抗病基因。根據DeWit(1991)的界定,基因對基因關系只是橫向考察植物—微生物互作的一個視點,只能反應植物與病原物雙方的適應與敵對。在這一過程中,雙方都有對另一方遺傳變化的連續性遺傳跟蹤能力。植物—微生物共同進化在使一部分微生物成為病原物的同時,也使植物按兩種機制獲得對病原物的抵抗能力,一種是組成型的,包括非寄主抗性和非親和互作中的寄主抗性,它們在受到病原物的初侵染時就能表達;另一種是誘導抗性,它需要在轉錄和翻譯水平上協同調控,這也是植物—微生物協同進化賦予植物的能力。Leach等認為,病原物與非寄主植物間的識別過程可能還有另一類異源無毒基因的參與。如,Magnaporthegrisea是水稻和許多雜草的病原菌,來自非寄主畫眉草的分離物含有獨特的無毒基因avr-Co39、avr-M201及avr-YAMO,帶這些無毒基因的菌株是水稻的非病原菌。M.grisea之所以成為水稻的病原菌,可能是在進化中失掉了這些異源無毒基因。因此,DeWit(1991)認為,非寄主抗性,除了因為對應的非病原物缺少特定致病因子外,擁有大量無毒基因可能是一重要因素。5生態活性化合物HR是非寄主抗性中的常見表型,表現為局部的細胞快速死亡。雖然在小種專化性抗性中,細胞死亡是R-avr互作中誘導的生理生化變化的直接結果,但非寄主抗性中HR表型并不需要R-Avr的介導,外源H2O2也可誘發PCD。一般認為,HR過程中包括活性氧中介物(reactiveoxygenintermediated,ROIs)導致產生的活性氧迸發、防衛相關基因表達、膜勢能改變、脂氧合酶活性增強,胞壁修飾、木質素沉積以及產生抗菌物質,如植保素等。ROIs在非寄主植物抗性中起關鍵信號作用(Bakeretal.,1997)。ROIs的產生,有些情況下需要Ca2+和離子通道的活化,它能在elicitor作用的幾分鐘內發生。ROIs可能直接激發HR或細胞死亡以及隨后誘導防衛相關基因表達。一種哺乳動物DADPH氧化酶抑制劑二聯苯胺碘(diphenyleneiodonium)可阻斷ROIs的產生和防衛反應,這表明在植物中也需要這一類似系統。擬南芥的某些突變體,可以用來解釋非寄主抗性以及非寄主抗性中HR和SAR的信號傳遞。5.1植物細胞抑制子基因植物中的HR受遺傳控制。在幾種植物上發現了在無病菌侵染情況下自發產生HR的突變株。擬南芥(Arabidopsis)植物可在lsd1和acd2位點產生突變,在無病原物侵染的情況下能形成自我繁育壞死斑、表達PR蛋白以及產生水楊酸。lsd1基因控制類似病害病斑(lesionsstimulatingdisease)的產生,acd2基因具加速細胞死亡(acceleratedcelldeath)的功能。這說明,野生型植物可能編碼了HR的抑制子,該抑制子可能是正常生長的植物所共有的。同時也表明,非寄主抗性的HR表型是病原物的某種產物抑制了該抑制子活性的結果。該抑制子可能是植物共有的。5.2sa和lasd2SAR與SA是否產生及PR蛋白是否表達有關。SAR和PR蛋白表達需要SA。SA是否作為誘導植物產生SAR的遠距離系統信號,目前仍不清楚。擬南芥的幾種突變體有助于探討產生SAR的信號機制。cpr1和lsd2突變體表現出SA水平增加和PR基因組成型表達,并且對毒性病原細菌和真菌的抗性增強。lsd2植株表現為組成型病斑表型,這說明LSD2編碼一負調控因子,作用在SA合成或感應的上游或作用于HR的下游。另一類型的突變位點,npr1和nim1,在對病原物侵染具有抗性反應中可誘導HR和SA積累,但經SA這樣的化學誘導劑處理時不表達PR基因。因此,NPR1可能作用于SA積累的下游。NPR1編碼的蛋白,含有錨蛋白重復,它可在許多真核生物蛋白中發現,具有蛋白—蛋白互作介導的多重功能(Grantetal.,1995)。NPR1可能起PR基因表達轉錄調控因子的作用。5.3vrrpt2和verpp3的抗菌