ccr7對乳腺癌細胞趨化活性與侵襲活性的影響

0ccr7在乳腺癌活檢和活檢中的表達許多腫瘤細胞可以特定地表達一些特征的受體，如csc4、ccr7、ccr10。現在，這些發現在癌癥器官的異質化過程中發揮了重要作用。其中，ccr7家族成員的slc（二級化療性肝腫瘤）和elc（ebi1-ligadchemarki）在淋巴結中表現出高度的特異性。大多數腫瘤細胞表面都有ccr7。研究表明，ccr7的出現與各種腫瘤的淋巴結轉移密切相關，包括癌、癌、癌等。然而，如果ccr7也參與了乳腺癌淋巴結轉移的形成，則沒有確定ccr7是否也參與了乳腺癌淋巴結轉移的形成。因此，我們在以外表面檢測了不同乳腺癌細胞株的ccr7表達，評估了ccr7的出現對外部scl誘導的乳腺癌細胞的趨勢和入侵的影響，為進一步研究乳腺癌細胞向淋巴結轉移的機制奠定了基礎。1材料和方法1.1其他逆轉錄酶和tt乳腺癌細胞株MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-361由本室常規傳代培養;TrizolRNA提取試劑盒,購自LifeTechnologies公司;M-MLV逆轉錄酶,DTT,DEPC等購自Gibco公司;Oligo-dT15購自Promega公司;TaqDNA聚合酶、dNTPs購自TakaRa公司;人趨化因子SLC由醫科院腫瘤研究所張叔人教授惠贈;人CCR7mAb購自R&DSystems公司;趨化小室與多聚碳酸酯膜(8.0μm孔徑,25mm×80mm),購自Neutroprobe公司.1.2方法1.2.1逆轉錄的制備各取1×106的不同乳腺癌細胞,按照TrizolRNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA.取6μg總RNA與0.5μgoligo-dT15混合,逆轉錄獲得cDNA.以其作為模板,PCR擴增CCR7中一大小為530bp的片段.所用的上游引物為5′–TCCTTCTCATCAGCAAGCTGT-3′,下游引物為5′–GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAAG-3′.具體反應步驟為:37℃1h,72℃5min,完成逆轉錄;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環完成PCR后,再72℃充分延伸10min.以人Tubulin作為內對照,其上游引物為5′-CTCATCACAGGCAAGGAAGAT-3′,下游引物為5′-TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3′,大小為410bp.擴增產物進行1.5g/L瓊脂糖凝膠電泳,以各自Tubulin作為內對照調整上樣量,電泳圖像經FluorsMulti-Imager凝膠成像掃描儀分析,比較乳腺癌細胞中CCR7的相對表達量.1.2.2多聚碳酸酯膜的制備采用Boyden趨化小室法體外行趨化活性分析,趨化實驗具體步驟如下:在趨化小室的底孔中,加入27μL含100nmol/LSLC的無血清RPMI1640培養液,同時以無血清RPMI1640培養液作為陰性對照加入底孔中;上面覆蓋8.0μm孔徑的多聚碳酸酯膜,再覆蓋上頂板.在趨化小室頂孔中加入50μL乳腺癌細胞(1×109/L重懸于無血清RPMI1640培養液中);將整個小室置37℃,50mL/LCO2孵育箱中作用8h.取出多聚碳酸酯膜,刮去上表面殘留的乳腺癌細胞,將整個膜置于40g/L甲醛中固定,再行姬姆薩染液染色;每組行3個復孔平行檢測,每個小孔隨機計數5個高倍視野下遷移至多聚碳酸酯膜背面乳腺癌細胞的總數,并計算趨化指數(chemotacticindex,CI),CI=檢測組平均遷移細胞總數/陰性對照組平均遷移細胞總數.1.2.3基質膠及其他血管內皮功能性狀的檢測仍然采用Boyden趨化小室法體外檢測乳腺癌細胞的侵襲活性,方法大致同趨化實驗,改動包括:在趨化小室頂孔的多聚碳酸酯膜上預先鋪入Matrigel基質膠(每孔約50μg),并且趨化小室在孵育箱中作用時間延長至20h,每組同樣行3個復孔平行檢測,每孔隨機計數5個高倍視野下遷移至多聚碳酸酯膜背面的乳腺癌細胞總數.以侵襲指數(invasionindex,II)表示侵襲活性,II=檢測組穿過基質膠平均細胞總數/陰性對照組穿過基質膠平均細胞總數.1.2.4不同處理乳腺癌細胞的活性檢測Boyden趨化小室法檢測趨化活性和侵襲活性的具體方法同上,底孔中各加入27μL含100nmol/LSLC的無血清RPMI1640培養液,頂孔中各加入50μL的1×109/L乳腺癌細胞的無血清RPMI1640培養液,再加入5mg/L的CCR7mAb進行受體封閉(此為處理組,同時以不加CCR7mAb的孔為對照組),每組均行5個復孔的平行檢測,分別行趨化活性和侵襲活性檢測,并分別計算抑制率.抑制率=(對照組平均遷移細胞總數-處理組平均遷移細胞總數)/對照組平均遷移細胞總數×100%.統計學處理:數據以xˉ±sxˉ±s表示,組間方差齊時采用t檢驗,方差不齊時采用非參數Mann-Whitney檢驗,統計學處理均采用SPSS10.0統計軟件包進行.2結果2.1ccr7的相對含量乳腺癌細胞系MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-361中,通過RT-PCR法均能擴增出人Tubulin基因片段和CCR7中選定的基因片段,以Tubulin為參照,比較各株乳腺癌細胞CCR7的相對含量.結果發現,3株乳腺癌細胞均有不同程度CCR7的mRNA表達,其中以MDA-MB-361表達量最高,MDA-MB-231次之,MCF-7表達量最低,三者CCR7相對含量分別為2.54,0.43,0.29(Fig1).2.2ccr7對3種乳腺癌細胞的趨化活性趨化小室法催化實驗發現:在100nmol/L的SLC作用下,遷移至多聚碳酸酯膜背面的3種乳腺癌細胞數,均明顯多于各自相應的陰性對照組遷移細胞數(Tab1).說明CCR7的配體SLC對3種乳腺癌細胞均有不同程度的趨化活性(Fig2).2.3打造乳腺癌細胞的擊穿活性同樣選擇100nmol/L濃度的SLC置于趨化小室底孔,行侵襲實驗檢測不同乳腺癌細胞的侵襲活性.結果發現:在SLC作用下,3種乳腺癌細胞均能夠穿透Matrigel基質膠到達多聚碳酸酯膜的背面,膜背面細胞數均明顯多于相應的陰性對照組,說明在SLC作用下3種細胞均表現出不同程度的侵襲活性(Tab2).2.4ccr7受體的封閉對乳腺癌細胞slc誘導的控制作用將乳腺癌細胞經CCR7單克隆抗體孵育后,分別檢測CCR7受體的封閉對SLC介導的乳腺癌細胞的趨化活性和侵襲活性的影響.結果發現,CCR7受體的封閉均能不同程度上抑制3種乳腺癌細胞SLC介導的趨化活性和侵襲活性(Tab3,4).結果說明,SLC對3種乳腺癌細胞的趨化活性和侵襲活性都應該是通過其受體CCR7介導的.3ccr7是乳腺癌細胞轉移的樞紐在生理狀況下,趨化因子及其受體對血細胞在體內的遷移與定位發揮重要的調節作用.然而近來研究發現,趨化因子及其受體在惡性腫瘤器官特異性轉移中也同樣發揮關鍵性作用.一般認為,不同的器官由于存在不同的趨化因子,對特異性表達相應受體的腫瘤細胞產生不同的趨化或募集作用,從而導致腫瘤細胞選擇性地向相應器官轉移.其中研究最多的是趨化因子受體CXCR4,它的配體SDF-1在淋巴結、肺臟、肝臟、骨髓等器官中高表達,腫瘤細胞表達CXCR4被認為與多種惡性腫瘤的淋巴結轉移、肝轉移、肺轉移、以及骨髓轉移密切相關,其中就包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神經母細胞瘤等.CCR6的配體CCL20在肝臟高表達,CCR6的表達可以介導惡性腫瘤細胞向肝臟轉移;表達CCR10的惡性黑色素瘤可以向表達相應配體CTACK的皮膚特異性轉移.對于趨化因子受體CCR7,其配體SLC、ELC主要在淋巴結中特異性高表達,生理狀況下CCR7及其配體介導淋巴細胞向淋巴結遷移與歸巢.然而Mashino等研究卻發現,大約2/3的胃癌組織也表達CCR7,并且CCR7的表達與胃癌淋巴結轉移密切相關;Takanami研究證實,CCR7的表達是一項與淋巴結轉移相關的小細胞肺癌的獨立預后因素,但是在乳腺癌中,尚沒有類似的臨床病理研究證據.我們推測CCR7及其配體可能也參與了乳腺癌細胞向淋巴結特異性轉移的過程.我們體外研究結果證實:乳腺癌細胞系也表達不同程度的CCR7;CCR7的配體SLC在體外可以促進乳腺癌細胞的趨化與侵襲,并且該兩種活性均可以通過CCR7受體的封閉而被抑制;另外,趨化活性與侵襲活性的強弱與乳腺癌細胞CCR7的表達水平可能相關,在MDA-MB-361細胞中CCR7表達高,表現出的趨化活性與侵襲活性也比較強.這些結果表明,CCR7及其配體促進了乳腺癌細胞的趨化與侵襲.而趨化活性和侵襲活性正是惡性腫瘤轉移的基本特性,CCR7的表達可能就促使了乳腺癌細胞向表達相應配體的淋巴結特異性轉移,當然結論的得出還需要進一步的體內研究和臨床證實.我們早期的預實驗還發現,配體(SLC)的濃度明顯與乳腺癌細胞的趨化活性和侵襲活性相關,濃度過高或者過低均會影響趨化活性和侵襲活性,理想的SLC濃度是50～500nmol/L.這一現象在SLC對T淋巴細胞的趨化中已經發現,50～500nmol/L的濃度范圍也