第四章電泳電泳是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現象。三大要素：帶電顆粒、電場、溶液。

電泳技術發展簡史1809年俄國物理學家Рейсе首次發現電泳現象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后發現正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現象。

1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。

1937年瑞典Uppsala大學的Tiselius對電泳儀器作了改進，創造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學獎。1948年Wieland和Fischer重新發展了以濾紙作為支持介質的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。

從本世紀50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質的分離以后，開創了利用各種固體物質（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質的區帶電泳方法。電泳可分為三大類：顯微電泳自由界面電泳區帶電泳1．顯微電泳它通過顯微鏡直接觀察分散于液相介質中的微粒在電場中的移動方向和速度，驗證微粒表面電荷的符號和密度，進而推測它們的組成和特點。在醫學及生物學領域中，顯微電泳技術常用于觀察細胞，這時的顯微電泳稱為細胞電泳。根據細胞表面的電荷密度，推測其構造和功能、大分子物質在細胞表面的吸附，以及在細胞表面進行的免疫反應等等。目前此法已用于研究膜結構以及癌細胞和正常細胞的差異性等方面。

2．自由界面電泳是膠體溶液的溶質顆粒經過電泳后，在膠體溶液和溶劑之間形成界面的電泳過程。

最簡單的界面電泳是在一“U”形管中裝入一定量的帶色膠體溶液如黃色硫化砷膠體溶液或血紅蛋白溶液，然后小心地分別在U形管兩端注入等量的稀電解質溶液(NaCl溶液或一定pH的緩沖液)，使其與膠體溶液之間有明顯的界面，接著在此管兩端放入鉑電極，通直流電，過一段時間即可看到—邊膠體溶液的界面上升，另一邊則下降。這是膠體顆粒產生泳動的結果。由于該電泳不受支持物的影響，所以分離效果較好，一般適用于膠體物質的純度鑒定及電泳速度的測定。

3．區帶電泳

是樣品物質在一惰性支持物上進行電泳的過程。因電泳后，樣品的不同組分可形成帶狀的區間，故稱區帶電泳，亦稱區域電泳。

采用不同類型的支持物進行該電泳時，能分離鑒定小分子物質(如核苷酸、氨基酸和肽類等)和大分子物質(如核酸、蛋白質，以及病毒顆粒等)。

優點：1）由于區帶電泳有支持物存在，能減少了界面之間的擴散和異常現象的干擾發生，某些支持物具有分子篩的效能，區帶電泳的靈敏度和分辨率可以提高。2）區帶電泳設備簡單、操作方便，已成為開展生物化學和分子生物學等研究工作的一種不可缺少的工具。第一節基本原理當把一個帶凈電荷(q)的顆粒放入電場時，便有一個力(F)作用于其上。F的大小取決于顆粒凈電荷量及其所處的電場強度(E)，它們之間的關系可用下式表示：F＝E·q

由于F的作用，使帶電顆粒在電場中向一定方向泳動。泳動過程中還受到一個相反方向的摩擦力（f·v)阻擋，當這兩種力相等時，顆粒則以速度(v)向前流動。v=F/f=E·q/f

式中f為摩擦系數。根據Stoke公式，阻力大小取決于帶電顆粒的大小、形狀以及所處介質的粘度，即f＝6∏rη式中r為顆粒半徑，η(Eta)為介質粘度。該公式系指球形顆粒所受的阻力。把f公式代入v公式得：V=E·q/6∏rη從公式可知，帶電顆粒在電場中泳動的速度與電場強度和帶電顆粒的凈電荷量成正比，而與顆粒半徑和介質粘度成反比。若顆粒是具有兩性電介質性質的蛋白質分子時，它在一定pH溶液中的電荷性質是獨持的。這種物質在電場中泳動一段時間后，便會集中到確定的位置上呈一條致密區帶。若樣品為混合的蛋白質溶液時，由于不同蛋白質的等電點和分子量是不同的，因此經電泳后，就形成了泳動度不同的區帶。利用此性質，便可把混合液中不同的蛋白質(或其它物質)分離開，也可用其對樣品的純度進行鑒定。泳動度(m)或遷移率是指在單位電場強度（1V/cm）時帶電分子的遷移速度。也可寫成下列公式：

式中d為帶電顆粒泳動的距離(cm)；l為支持物的有效長度(cm)，t為通電時間(秒)；V為加在支持物兩端的實際電壓(伏特)。在一定的條件下，任何帶電顆粒都具有自己的特定泳動度。它是膠體顆粒的一個物理常數，可用其鑒定蛋白質等，還可用其研究蛋白質、核酸等物質的一些化學性質。影響泳動速度的因子有顆粒的性質、電場強度和溶液的性質等。

M=υE=d/tV/l=d·lV·t影響電泳的因素六大因素1．顆粒性質

顆粒直徑、形狀以及所帶的靜電荷量對泳動速度有較大影響。一般來說，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就越快。反之，則越慢。

2．電場強度

電場強度對泳動速度起著十分重要的作用。電場強度越高，帶電顆粒的泳動速度越快。反之，則越慢。

電泳分為：常壓電泳和高壓電泳。前者電場強度為2-10伏特／厘米，后者為70-200伏特／厘米。用高壓電泳分離樣品需要的時間比常壓電泳短。3．溶液性質是指電極溶液和蛋白質樣品溶液的pH值、離子強度和粘度等。（1)pH值

溶液pH值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電荷的量。對蛋白質而言，溶液的pH值離其等電點愈遠，則其帶凈電荷量就愈大，從而泳動速度就越快。反之，則越慢。(2)離子強度

溶液的離子強度一般在0.02-0.2之間時，電泳較合適。若離子強度過高，則會降低顆粒的泳動度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴散層。這種靜電引力作用的結果，導致顆粒泳動度降低；若離子強度過低，則緩沖能力差，往往會因溶液pH值變化而影響泳動度的速率。

(3)溶液粘度

前面提到泳動度與溶液粘度是成反比例關系，因此粘度過大或過小，必然影響泳動度。I=1/2∑CiZi2式中I為離子強度；Ci為離子的克分子濃度；Zi為離子的價數。例1、兩個單價離子化合物（如NaCl）的離子強度等于它的克分子濃度。如0.154mol/LNaCl的溶液的離子強度可計算如下：I=1/2（0.154×12+0.154×12）=0.154

4．電滲當支持物不是絕對惰性物質時，常常會有一些離子基團如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對帶電。在電場作用下，此溶液層會向負極移動。反之，若支持物的離子基團吸附溶液中的負離子，則溶液層會向正極移動。溶液的泳動現象稱為電滲。因此，當顆粒的泳動方向與電路方向一致時，則加快顆粒的泳動速度；當顆粒的泳動方向與電泳方向相反時，則降低顆粒的泳動速度。

5．焦耳熱在電泳過程中，電流強度與釋放的熱量(Q)之間的關系可列成如下公式:Q＝I2Rt式中R為電阻，t為電泳時間，I為電流強度。公式表明，電泳過程中釋放出的熱量與電流強度的平方成正比．當電場強度或電極緩沖液中離子強度增高時，電流強度會隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴重時會燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。

6．篩孔支持物瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質顆粒泳動速度快。反之，則泳動速度慢。除上述影響泳動速度的因子外，溫度和儀器裝置等因子的影響也應考慮。

第二節紙電泳是用濾紙作支持物的一種電泳方法。紙電泳除了以濾紙作為支持物外，還可以醋酸纖維素紙(或膜)作為支持物。用后一支持物進行的電泳稱醋酸纖維素膜電泳，它的操作與紙電泳有相似的地方，但分辨率比紙電泳高。第三節聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE(polyacrylamidegelelectrophoresis)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳方法。它是在淀粉凝膠電泳的基礎上發展起來的。Davis和Ornstein于1959年報道了聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法，并用該法成功地對人血清蛋白進行了分離。從此，這種電泳方法成了分離蛋白質和核酸等大分子物質的重要工具之一，目前已在科研、教學及生產等方面廣泛應用。聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。調節單體濃度，或單體和交聯劑的比例，就能得到孔徑不同、范圍廣泛的凝膠物質，而且重復性好；聚丙烯酰胺凝膠機械強度好，彈性大(類似橡皮)，有利于電泳后進行各種處理；聚丙烯酰胺凝膠是-C-C-C-C……連接的多聚體，側鏈除不活潑的酰胺基外，并無其它離子基團，故無電滲作用；優點：設備簡單，所需樣品量少（1-100微克)，分辨率較高。用此方法進行超微量分析時，可檢出含量在10-12-10-9克分子的樣品.用途廣，能對蛋白質、多肽和核酸等大分子物質進行分離和分析(包括定性和定量分析)；能用于對毫克水平材料的制備，還能用于對蛋白質和核酸分子量的測定等方面。一、基本原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在加速劑N，N，N

，N-四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)或核黃素(VB2)的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱PAGE)。圖1夾心垂直板電泳槽示意圖

1.樣品槽模板；2.長玻璃板；1.導線接頭；2.下貯槽；3.凹形橡膠框；4.樣品槽模板；5.固定螺絲；6.上貯槽；7.冷凝系統圖2聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7；(2)濃縮膠pH6.7；(3)分離膠pH8.9；(4)電極緩沖液pH8.3圖3蛋白質微型電泳系統

1.聚丙烯酰胺凝膠的合成

(1)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺量的確定聚丙烯酰胺凝膠的孔徑大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度(T)，以及雙體占總濃度的百分含量(C)即交聯度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的。而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加。凝膠濃度的計算公式如：式中a代表單體的重量(g)；b代表雙體的重量(g)；m代表溶液的體積(ml)。交聯度(C)可按下式計算：

a與b的比值(W/W)對凝膠的篩孔、透明度和機械強度等性質也有明顯影響。當a/b＜10時，凝膠變硬呈乳白色；當a/b＞100時，5％凝膠呈糊狀,且易斷裂。綜上可知，凝膠濃度不同，其交聯度是不同的。交聯度隨著總濃度(T)的增加而降低。因此，當總濃度一定、交聯度增加時，將導致篩孔直徑降低。根據這個道理，Rihard等在1965年提出了適合于確定凝膠濃度為5%-20％范圍內交聯度的經驗公式：C=6.5—0.3T如選用總濃度T分別為5％和10％時，依照上述公式便可計算出交聯度C應分別為5％和3.5％。Fawcett提出了另一種看法：當凝膠總濃度不變，交聯度為5％時，篩孔直徑最小；大于或小于此交聯度時，篩孔直徑均變大。因此，目前有些實驗室采用a/b＝19/1的配方。C值是由T值決定的，或是固定值(5％)。而T值則依據分離物質的分子量大小來確定。因為蛋白質或核酸在不同濃度凝膠中的遷移率，是隨著總濃度的增加而降低的。所以在分離不同分子量的混合物時，只有選擇適宜濃度的凝膠才能奏效。常用于分離血清蛋白的標準凝膠是指濃度為7.5％的凝膠。用此膠分離大多數生物體內的蛋白質，電泳結果一般都較滿意。當分析一個未知樣品時，常常先用7.5％的標準凝膠或用4％-10％的梯度凝膠試驗，以便選到理想濃度的凝膠。當分離物的分子量已知時，選擇何種濃度凝膠為佳，可參考表12—3

①化學聚合：化學聚合的催化劑一般是過硫酸銨(AP)，加速劑是脂肪叔胺如四甲基乙二胺(TEMED)、三乙醇銨和二甲基氨丙腈等。其中以TEMED為最好。當Acr、Bis和TEMED的水溶液中加入過硫酸銨時，過硫酸銨[(NH4)2S2O8]立即產生自由基：S2O8-、2SO4-；丙烯酰胺與自由基作用后，隨即“活化”。活化的丙烯酰胺彼此連接形成多聚體長鏈：(2)丙烯酰胺的聚合

丙烯酰胺聚合時，常用的催化系統有化學聚合和光聚合。含有這種多聚體鏈的溶液盡管比較粘稠，但不能形成凝膠。只有當交聯劑(bis)存在時，才能形成凝膠。在過硫酸銨—TEMED催化系統中，從Acr和Bis聚合的初速率與過硫酸銨濃度的平方根成正比，并且在堿性條件下反應迅速。例如、7％的丙烯酰胺溶液要完全聚合，在pH8.8時，僅需30分鐘；而在pH4.3時，則需90分鐘。此外，溫度、氧分子和雜質等都會影響聚合速度。一般在室溫下比在零度下聚合快，溶液預先抽氣的比不抽氣的聚合快。膠體的聚合反應Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)(O4S-SO4)2-

–—2SO4-自由基的生成者成膠的基本單位Acrylamide(monomer)架橋使聚合產生分枝Bis(acrylamide)(bridge)幫助傳遞自由基的催化劑TEMED(catalyst)SDS(Sodiumdodecylsulfate)

②光聚合：催化劑是核黃素。光聚合過程是一個光激發的催化反應過程。在氧及紫外線作用下、核黃素生成含自由基的產物，自由基的作用如同上述的過硫酸銨一樣。通常將反應混合液置于一般熒光燈旁，即可使反應發生。用核黃素催化時，可不加TEMED，但是加入后會使聚合速度加快。光聚合形成的凝膠呈乳白色，透明度較差。用核黃素催化劑的優點是，用量極少(1mg／100ml)，對分析樣品無任何不良影響；聚合時間可以自由控制，改變光照時間和強度．可使聚合作用延遲或加快。化學聚合后的凝膠孔徑比光聚合的小，而且重復性和透明度也比光聚合的好。但是化學聚合的催化劑過硫酸銨是強氧化劑，若殘存于凝膠中往往會使某些蛋白質分子喪失活性，或者產生不正常的電泳圖譜。

2.分離效應

用凝膠電泳分離血清樣品時，除了與紙電泳一樣具有電荷效應外，還有濃縮效應(不連續電泳發生于濃縮膠中)和分子篩效應(發生于分離膠中，故其分辨率比紙電泳高。

(1)濃縮效應

當分離膠和濃縮膠選用pH6.7Tris／HCl緩沖液、電極液選用pH8.0Tris／甘氨酸緩沖酸時，在電泳的開頭，鹽酸幾乎全部解離釋放出氯離子（C1-)，甘氨酸(pI為6.0、pK′a為2.34，pK″為97)則只有1％-0.1％解離釋放出甘氨酸根離子(NH2-CH2-COO-)，而酸性蛋白質一般在濃縮膠中解離為帶負電荷的離子。這三種離子帶有相同類型的電荷，并同時向正極移動。其有效泳動率按如下次序排列：

mcl-·a-＞m蛋-·a蛋-＞m甘-·a甘-式中m代表泳動率，n代表解離度，ma代表有效泳功率。根據有效泳動率的大小區分，把最快的Cl-稱為快離子，又稱前導離子)；把最慢的NH2-CH2COO-稱為慢離子(又稱尾隨離子)。在電泳剛開始時，三層凝膠(樣品膠、濃縮膠和分離膠)中都含有快離子。只是電極緩種液中含有慢離子。電泳進行時，由于快離子的泳動率最大，因此很快超過蛋白質，于是在快離子后邊形成一離子濃度低的區域，即低電導區。電場強度與電導成反比關系：E＝1/η(伏／厘米)，式中E代表電場強度、1代表電流強度，η代表電導率。由于電導與電勢梯度成反比，因而在低電導區可產生較高的電勢梯度。這種高電勢梯度使蛋白質和慢離子在快離子后面加速移動。因而在高電勢梯度和低電勢梯度之間形成一個迅速移動的界面，由于樣品中蛋白質的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，所以，也就聚集在這個移動的界面附近，逐漸被濃縮，在到達小孔徑的分離膠時，已形成一薄層。最后，樣品在電泳開始時，通過濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層(一般能濃縮幾百倍)，然后再被分離。樣品濃縮膠分離膠快離子慢離子蛋白質ABC++-+界面--(2)電荷效應

當各種離子進入pH8.9的小孔徑分離膠后，甘氨酸離子的電泳遷移率很快超過蛋白質，高電勢梯度也隨之消失，在均一電勢梯度和pH的分離膠中，由于各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷量不同，在電場中所受引力亦不同，經過一定時間電泳，各種蛋白質就以一定順序排列成一條條蛋白質區帶。(3)分子篩效應由于分離膠的孔徑較小，分子量大小或分子形狀不同的蛋白質通過分離膠時，所受阻滯的程度不同，因而；遷移率不同而被分離。此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，受阻滯的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各種蛋白質按分子大小順序排列成相應的區帶。二、操作

1．不連續垂直板狀凝膠電泳2.不連續垂直柱狀凝膠電泳

主要討論垂直板狀不連續電泳操作

2．不連續垂直板凝膠電泳(1)裝置

垂直板凝膠電泳的裝置是由電泳儀和電泳槽構成。它的膠板則是由二塊正方形或長方形、大小適中、性質均一的玻璃板，三種不同厚度(分別為2、3、4mm)的塑料條或硅橡膠條和一個“梳子”組成。二者柱狀凝膠電泳相比，垂直板凝膠電泳有表面積大、溫度好控制、凝膠易取出、可作雙向電泳、在同一膠板上一次能檢測多個樣品等優點。（2）操作①膠板模型的粘合在干凈玻璃板的三條邊上(距邊緣5mm處)，用去掉針頭的5毫升注射器連續擠下高真空硅酮油，使其成不間斷的線狀，或涂上薄薄的一層醫用凡士林。接著把塑料條(寬5mm)小心地壓在油脂上，讓油脂在塑料條與玻璃板之間形成一透明薄層(＜1mm)。油脂不宜涂得太多，其寬度亦應小于塑料條。然后在塑料條上用上述方法加一層油脂，隨即將另一塊玻璃板壓在其上，用夾子夾緊。②凝膠板的制備A.加入分離膠：根據分離樣品的性質選擇一定的凝膠濃度(T值)，然后加入過硫酸銨溶液，混勻后使凝膠溶液沿玻璃壁來回移動慢慢注入，謹防產生氣泡。當液面高度達玻璃壁的2/3左右時停止加入，隨后在分離膠的頂端加入約0.5厘米高的緩沖液，使液面平坦，同時可使其與空氣隔絕，以利聚合。一般情況下，置室溫30分鐘左右即可以聚合，再過30分鐘即聚合完全。B.加入濃縮膠：當分離膠凝聚后，小心地吸去上層溶液，再用濾紙條吸干。接著用加分離膠的方法加濃縮膠，加濃縮膠到離玻璃板頂約1厘米處時，把與凝膠厚度一樣的“梳子”插入其頂部。待膠完全聚合后，拿出“梳子”，于是在聚丙烯酰胺膠中便鑄出若干上樣品的凹穴。試劑名稱分離膠(8%)濃縮膠(4%)分離膠緩沖液1.25ml/濃縮膠緩沖液/0.5ml水2.4ml1.2mlTEMED10ul5mlAP60ul25ul聚丙烯酰胺凝膠配制③上樣和電泳A.樣品處理適量濃度蛋白溶液加入1×上樣緩沖液混勻，95℃水浴中處理5分鐘。

B.加樣

用微量進樣器取10-15

l上述混合液，通過電極緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。C.電泳將電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接，打開電泳儀開關，開始時電流為10mA，待樣品進入分離膠后，將電流調至20-30mA，當溴酚藍染料距硅膠框1cm時，停止電泳，關閉電源。

注意：A.制備樣品時，離子強度不能太高。否則電導太大，不能在樣品部分產生電壓梯度，從而降低濃縮效應，甚至使樣品泳動緩慢。電泳開始后，樣品液應在5-10分鐘內進入凝膠。指示染料進膠緩慢，是樣品的鹽濃度(離子強度)太高的表現。對含高鹽濃度的樣品須在電泳前進行透析去鹽，使其電導值低于分離膠，這才能達到預期的濃縮效果。B．樣品液中的沉淀和混濁等物質必須除去。不然會有許多物質留在凝膠界面上，堵塞凝膠篩孔，影響樣品的分離。當樣品裝載量與樣品溶解度不相適應時．就會在電泳過程中連續發生沉淀、溶解．結果導致拖尾現象的產生。C．當樣品溶液有聚合或不溶解情況發生時，可在8mol/L尿素系統中電泳，在此系統中遷移率往往會低一些。④固定、染色與脫色

電泳結束后，取下凝膠模，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標記，在兩側溴酚藍染料區帶中心，加入染色液染色1-2h，再用脫色液脫色，直至蛋白質區帶清晰，即可計算相對遷移率.A．固定：把取出的凝膠柱浸泡在7％醋酸或12.5％三氯醋酸水溶液中幾分鐘到幾小時，以固定其中含有的蛋白質組分。有時也可把凝膠柱浸泡在用上述溶液配制的染料混合溶液中，使固定與染色同時進行。其一是用氨基黑、考馬斯亮藍、阿爾辛藍、過碘酸-schiff試劑以及銀試劑檢測；其二是用熒光標比和放射性同性素標記法；其三是特殊試劑染色法.B．染色：蛋白質(包括糖蛋白和酶)的譜帶可用三種方法染色檢測。⑥掃描與分析A.凝膠成像系統B.遷移率的測定：遷移率的測定及計算方法。根據各蛋白質樣品區帶中心與加樣端的距離(cm)，按下式計算相對遷移率mR: 蛋白質樣品距加樣端遷移距離(cm) 溴酚藍區帶中心距加樣端距離(cm)相對遷移率mR=

2．不連續垂直柱狀凝膠電泳

(1)裝置

不連續柱凝膠電泳裝置有三部分組成即，電泳槽，玻璃管和電泳儀。

①電泳槽：電泳槽分為上下兩層，其形狀均為圓筒形。下層無特殊設備，上層底板中央裝有鉑金絲電極，在其周圍以相等距離打10個小孔．在孔中插入玻璃管后，設法使溶液不發生滲漏現象。②玻璃管：一般內徑5-7毫米，外徑7-9毫米，長度10厘米左右，玻璃的性質均一，呈弱堿性，管口用金鋼砂磨平，要切忌火燒，否則剝膠困難．

③電泳儀：它是一種恒壓恒流的電源裝置，其量程通常為600伏、100毫安。第四節瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳是用瓊脂糖或優質瓊脂粉作支持物的一種電泳方法。用瓊脂糖膠分離雙鏈DNA時，其遷移率大小，主要與樣品的分子量有關，而與核酸的一級結構以及堿基的組成無關。瓊脂糖電泳對于分離或分析天然DNA，包括不同形式的質粒DNA[即閉環DNA(cc-DNA)、開環DNA(oc-DNA)和線性DNA(1-DNA)]以及不同分子量的核酸片段都有效。

基本原理是電荷效應及分子篩效應(分離小分子物質時無此效應)。當瓊脂糖介質的濃度較低時，膠的篩孔較大，適用于分離大分子(70bp以上)的核酸或蛋白質及其復合物。[聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析（SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP）]二、操作1.緩沖濃的配制

在配制緩沖液時，不論那一種都須加適量的EDTA，以便除去二價的金屬離子。另外，硼酸與瓊脂糖易形成復合物，因此一般Tris—硼酸緩沖液使用較少。2．瓊脂糖凝膠板的制備稱取一定量的瓊脂糖加入玻璃瓶中，按所需凝膠的濃度加入適量的電極緩沖液，用棉塞將瓶口塞緊，置消毒鍋4.4×104Pa處理15分鐘，或在沸水浴中加熱熔化約0.5小時。待該溶液冷卻到60℃左右，加入溴化乙錠(取自用水配制的10mg/m1的貯備液，4℃存放)，最后濃度0.5ug/m1。搖勻后，即可用滴管吸取此液，封閉干凈玻板(10×15cm)與模框的連接處，以形成一個長方形的模型。然后將“梳子”固定于玻板適當位置上，接著將凝膠溶液注入模型中，使其厚度為3mm。室溫放置30-45分鐘后，小心地移走“梳子”和模框，即制成了瓊脂糖凝膠板。

3．加樣和電泳將瓊脂糖凝膠板平移至電泳槽中，注入緩沖液(液面高于膠面)，接通電源，電壓應低一點，在負極端每平方厘米的樣品孔（深＜3mm)中可加核酸樣品10-50ug，體積可達200ul。在樣品中應先加入示蹤染料(0.2溴酚藍和40％蔗糖混合水溶液)。隨之電壓可調高一點，當樣品進入凝膠后，使其維持在6v/cm左右．當溴酚藍移至陽極端時，關閉電源。4．觀察取出凝膠板，在254nm紫外燈下觀察。核酸存在的位置呈現紅色熒光區帶，照相時，要加紅色濾光片。第五節SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS即十二烷基硫酸鈉(SodiumDodecylSulfate)是陰離子表面活性劑，它能以一定的比例和蛋白質結合，形成一種SDS-蛋白質復合物。此復合物可用具有SDS聚丙烯酰胺凝膠(包括連續的和不連續的系統)電泳進行分離，通常把這種電泳稱為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS)。

用途：是分離蛋白質和測定其分子量。原理聚丙烯酰胺凝膠電泳把蛋白質分開的主要依據：

它的遷移率取決于它所帶凈電荷、分子的大小和形狀等因素。

SDS的主要依據：是各種物質分子量的差異性。因為當SDS與蛋白質結合后，蛋白質分子即帶有大量的負電荷，超越其原來的電荷，從而使天然蛋白質分子間的電荷差別就降低乃至消除。同時蛋白質在SDS作用下結構變得松散，形狀趨向一致．所以各種SDS蛋白質復合在電泳時產生的泳動率差異，反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數與其在凝膠中的遷移率呈現直線關系。一般用下式表示：

lgM=a-bRf式中M代表分子量．a代表常數．b代表斜率，Rf代表遷移率另外，SDS-蛋白質復合物在強還原劑(如巰基乙醇)存在下蛋白質分子內二硫鍵被打開，而不被氧化，這樣分離出的譜帶即為蛋白質亞基。

影響蛋白質結合SDS的量的因素：(1)溶液pH、離子強度和緩沖液組分；

(2)蛋白質中完整二硫鍵；

(3)蛋白質的種類。

例如、糖蛋白和某些酶(如葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶以及白蛋白酶等)與SDS的親和力較低。注意：同一種蛋白質在不同條件下，結合SDS的量是不同的，而不同SDS的含量，將會致使其產生不同的泳動度。因此，用SDS測定蛋白質分子量時，應在統一的條件下進行。電泳中常出現的一些現象：

︶條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

︵條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

拖尾：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊擴散：加樣量過多。第六節印跡法印跡法(Blotting)是近十余年來發展起來的一種新方法。

Southern于1975年建立了檢測特異DNA片段的DNA—RNA雜交法，稱做Southern印跡法。Alwine等于1977年把此方法應用到RNA的研究方面，稱做Northern印跡法。

Towbin等于1979年則把該方法擴展應用到蛋白質分析方面，稱做western印跡法Reinhart于1982年報道的雙向蛋白質印跡法，稱做Eastern印跡法。

1、概念(1)探針：用化學方法特有識別能力的物質(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根過氧化物酶)或同位素(如3H、35S32P)，或熒光物質(如異硫氰熒光素／地高辛等)結合成的復合物稱作探針。

(2)固相載體：即用于吸附生命大分子物質的固體材料。這類材料有NC(Nitrocellulose)紙、DBM(Diazobenzy-loxymethyl)紙和DPT(Diazophenylthiaether)紙等。最常用的是孔徑為0.45um的NC紙。因為它成本低廉，背景較清晰。目前有人把Southern、Northern和western印跡法分別稱作DNA、RNA和蛋白質印跡法。每一種印跡法又可分為斑點印跡法和電泳轉移印跡法。前者是將樣品直接吸附于固相載體上，后者則是將樣品先經過電泳后再轉移到固相裁體表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白質等大