基于表面等離子體共振生物傳感器的2,4二硝基苯檢測模型的建立

在空間結(jié)構(gòu)的過程中，液體層的一些生化指標與生理功能密切相關(guān)。因此,在美國的天空實驗室、航天飛機、空間實驗室等飛行中備有專門的血樣、尿樣收集裝置,飛行結(jié)束后將樣品帶回地面進行檢測。但該方法對航天員的健康監(jiān)測有一定的滯后性,無法針對特殊情況及時采取應(yīng)對措施。如能實時監(jiān)測同機體健康狀態(tài)相關(guān)的生化指標,對于研究空間因素對機體影響的機制并及時采取措施,保障航天員的健康和工作效率具有重要意義。建立航天員體液在線監(jiān)測系統(tǒng),生物傳感器技術(shù)是可選擇的途徑之一。其中,表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,SPR)生物傳感器因具有靈敏、實時、樣品無需預(yù)處理、操作簡便、抗干擾能力強等優(yōu)點,已在生命科學研究、食品及飲料質(zhì)量檢驗等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。由于其檢測原理是非力學依賴性的,可應(yīng)用于微重力環(huán)境,對空間飛行中航天員體液的在線監(jiān)測有重要意義。然而低分子量且低質(zhì)量濃度的分析物,如體液中的激素、小肽等,檢測靈敏度不夠高。為提高小分子的檢測靈敏度,本實驗室根據(jù)抑制性免疫檢測原理,在以SPR傳感器為核心的便攜式生物分子在線分析系統(tǒng)(portableonlinebio-moleculesanalyzer,POBA)的基礎(chǔ)上,以2,4-二硝基苯肼(DNPH)檢測為模型,篩選得到了靈敏、快速、穩(wěn)定的生物分子膜制備及小分子檢測體系。將該技術(shù)進一步完善與發(fā)展,可望應(yīng)用于空間飛行中航天員體液在線監(jiān)測。dnph、bsa和體外生物分子膜的制備儀器圖1為便攜式生物分子在線分析系統(tǒng)構(gòu)成示意圖。其核心是SPR生物傳感器,根據(jù)檢測需要在其測試面制備不同的生物分子膜,組裝到一體化流過池內(nèi)用于檢測。整個系統(tǒng)可應(yīng)用于生物分子濃度的自動化檢測。試劑2,4-二硝基苯肼(2,4-Dinitrophenylhydrazine,DNPH,C6H6N4O4)、4-羥基-3甲氧基-苯乙二醇(4-hydroxy-3-methoxy-phenylglycol)、3,4-二羥基苯乙二醇(3,4-Dihydroxy-phenylglycol)、2,4-二硝基苯酚-L-細胞溶解酶(2,4-DNP-L-Lysin)、3-甲氧基-酪氨酸(3-methoxytyramine)、Nε-3-羥基-酪氨酸鹽酸(Nε-3-hydroxy-tyramin-hydrochorid)、胎牛血清白蛋白(BSA)、胎牛甲狀腺球蛋白(BTG)均購自Sigma公司。DNP抗體由本實驗室自制。生物分子膜的制備滴加DNP-BSA溶液于潔凈的SPR傳感器測試面,空氣中自然干燥,40℃固化,超純水沖洗,即完成生物分子膜的制備。DNPH的檢測200μg/ml的DNP單克隆抗體倍比稀釋,依次泵入反應(yīng)池并停留5min,緩沖液沖洗至折射率曲線平穩(wěn)。以抗體濃度為橫坐標,折射率(refractiveindex,RI)變化值為縱坐標,作標準曲線。在線性范圍較好的區(qū)間選擇適當?shù)目贵w濃度。4μg/mlDNPH倍比稀釋,濃度范圍在2ng/ml～4μg/ml,分別與等體積的100μg/ml的抗體混勻,室溫下充分反應(yīng)。泵入反應(yīng)池內(nèi)停留5min,緩沖液沖洗至折射率曲線平穩(wěn),記錄樣品加入前后的RI變化值。生物傳感器再生每檢測完一個樣品,泵入再生液,洗去與DNP-BSA結(jié)合的抗體,PBS緩沖液沖洗至RI曲線平穩(wěn)。dnph與抗體檢測能力的相關(guān)性生物分子膜的制備用DNP-BSA制備生物分子膜后,RI升高8.84×10-4。為檢測制備效果,將3%BSA溶液泵入反應(yīng)池并停留60min,反應(yīng)前后RI無變化(曲線未顯示)。DNPH的檢測區(qū)間不同濃度抗體流經(jīng)反應(yīng)池引起的折射率變化如圖2(a),作標準曲線如圖2(b)。抗體濃度在0～100μg/ml范圍內(nèi),與折射率變化的線性相關(guān)性較好。為了提高檢測的準確性,抗體濃度不應(yīng)過低,確定其使用濃度為50μg/ml。不同濃度的DNPH與抗體溶液充分反應(yīng)后流經(jīng)反應(yīng)池引起的折射率曲線變化如圖3(a),做標準曲線如圖3(b)。計算得到DNPH的線性范圍為7.8ng/ml～2μg/ml,檢測下限為2.5ng/ml。作為參照,第一個與最后一個樣品為25μg/ml的DNP抗體,二者折射率分別為1.969×10-4和1.845×10-4。傳感器重復(fù)性連續(xù)測定35μg/ml抗體50次,RI變化為(3.416±0.253)×10-4,相對標準偏差(RSD)為7.39%,第50次RI變化值比第1次下降7.2%。圖4為傳感器連續(xù)10次檢測曲線。dnph與srp的定量檢測利用SPR生物傳感器直接檢測生物分子,常面臨如下問題:1)某些分子量小、含量低的生物分子,在傳感器測試面結(jié)合后的響應(yīng)信號小,靈敏度差;2)預(yù)先固化在傳感器上的抗體常溫下易失活,不適用于航天、野外等特殊環(huán)境。為提高靈敏度,目前常用的方法有:1)在直接法檢測系統(tǒng)中引入生物素-親合素;2)待測分子結(jié)合在生物分子膜后再結(jié)合其配體,利用夾心法提高檢測靈敏度;3)用膠體金、脂質(zhì)體標記待測小分子,以放大響應(yīng)信號。但上述方法不適用于DNPH的快速、便攜檢測。DNPH分子很小,僅有1個抗原表位,無法用夾心法測定;對它進行標記,步驟繁瑣,不能在野外、空間等特殊環(huán)境下簡便的實現(xiàn),且操作過程會造成檢測結(jié)果的誤差。針對以上原因,本實驗室采用抑制性免疫檢測法,通過溶液中過剩的抗體濃度反映待測生物分子的濃度,實現(xiàn)了小分子的靈敏檢測。固化在測試面上的抗原常溫下能長時間保持其免疫原性,適用于此類小分子半抗原。本實驗室用抑制性ELISA方法檢測DNPH,其線性范圍為7.8ng/ml～2μg/ml,檢測下限為1.7ng/ml;二者檢測靈敏度基本相同,而SRP技術(shù)還具有實時、不受力學因素影響、儀器易實現(xiàn)自動化、便攜化等優(yōu)點,在空間環(huán)境中應(yīng)用具有重要意義。理論上,若能徹底去除結(jié)合抗體且不影響抗原在傳感器生物分子膜的活性,此傳感器生物分子膜可反復(fù)使用。實驗證明:1)樣品濃度越低,與膜表面的生物分子作用時間越長,導(dǎo)致的RI變化越大,再生所需時間就越長;2)新制備的生物分子膜,前幾次再生需時較短,其后,再生時間在一定范圍內(nèi)不會對基線造成影響(曲線未顯示);3)若前一樣品引起的RI上升很小,是否再生對下一樣品的檢測影響不大;4)在可選擇范圍內(nèi),再生時間宜短不宜長。分析認為,樣品在反應(yīng)池內(nèi)停留僅幾分鐘,生物分子膜遠沒達到飽和,只需保證再生后測試面的抗原結(jié)合能力遠大于抗體結(jié)合所需量即可。既避免破壞生物分子膜,又縮短了檢測總時間。重復(fù)性實驗結(jié)果表明傳感器的再生方法基本滿足多樣品檢測的需求。為了進一步提高檢測的準確性和可信度,可通過改變再生液成分、PH值、調(diào)整再生時間和流速等方法對其進行優(yōu)化。為評價該方法檢測特異性,表1列出了相同摩爾濃度的DNPH類似物與抗體混合溶液流經(jīng)傳感器所引發(fā)的RI變化值。由結(jié)果可見,含間位硝基苯環(huán)的一類化合物引發(fā)的RI變化最小,說明其能與抗體特異性結(jié)合;含苯環(huán)或硝基基團的類似物及載體蛋白BSA、BTG引發(fā)RI變化與抗體引發(fā)RI變化基本或完全相同,說明它們與抗體無反應(yīng),這與抗體的特異性相符合。因此,用DNP-BSA制備生物分子膜不會造成檢測的非特異性,后者主要決定于所用抗體的特異性。結(jié)果顯示,一個樣品的檢測包括樣品結(jié)合、PBS沖洗和傳感器再生3個步驟。樣品在反應(yīng)池中反應(yīng)5min,PBS沖洗2min,再生時間因具體情況5～10min不等,每個樣品的檢測需時平均15min,檢測需時較短。實際樣品檢測便攜式生物分子在線分析系統(tǒng)根據(jù)光學信號變化反映分子濃度,不受電、磁、力干擾,適用于空間環(huán)境;能實時分析生物分子間相互作用,檢測結(jié)果最終轉(zhuǎn)化為電信號,與航天員的生理信息一同傳輸給地面醫(yī)監(jiān)人員,據(jù)此對航