第九章基因工程和基因組學(xué)

第一節(jié)基因工程第二節(jié)基因組學(xué)1制作：王洪剛李斯深第一節(jié)基因工程

基因工程概述

限制性?xún)?nèi)切核酸酶

載體

基因的分離與鑒定

基因工程的應(yīng)用2制作：王洪剛李斯深基因工程概述★遺傳工程一般可分為廣義和狹義的兩種。廣義的遺傳工程包括細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程等。狹義的遺傳工程即是通常講的基因工程。本節(jié)只介紹基因工程。★基因工程中的DNA重組主要是指創(chuàng)造自然界中沒(méi)有的DNA分子的新組合。這種重組不同于經(jīng)典遺傳學(xué)中經(jīng)過(guò)遺傳交換產(chǎn)生的重組。基因工程是采用分子生物學(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來(lái)的基因操作技術(shù)。3制作：王洪剛李斯深★從細(xì)胞和組織中分離DNA。★利用能識(shí)別特異DNA序列的限制性?xún)?nèi)切核酸酶(restrictionendonucleases)酶切DNA分子，制備DNA片段。★將酶切的DNA片段與載體DNA連接，構(gòu)建重組DNA分子。★將載體與DNA片段構(gòu)成的重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，該重組DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)完全相同的拷貝，即克隆(clones)。★重組DNA能隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞，使子代群體細(xì)胞均具有重組DNA分子的拷貝。★能從宿主細(xì)胞中回收、純化和分析克隆的重組DNA分子。★克隆的DNA能轉(zhuǎn)錄成mRNA、翻譯成蛋白質(zhì)。能分離、鑒定基因產(chǎn)物。一基因工程概述4制作：王洪剛李斯深目的基因的獲得目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選重組克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離基因工程的內(nèi)容一基因工程概述5制作：王洪剛李斯深重

組

DNA

技

術(shù)一基因工程概述6制作：王洪剛李斯深二限制性?xún)?nèi)切核酸酶

★限制性?xún)?nèi)切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是細(xì)菌中這些酶的功能是降解外來(lái)DNA分子的一類(lèi)酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染。★限制性酶據(jù)其作用特點(diǎn)，可分為兩類(lèi)。

※第Ⅰ類(lèi)限制性酶每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒(méi)有序列特異性。

※第Ⅱ類(lèi)限制性酶能識(shí)別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列。第Ⅱ類(lèi)限制性酶識(shí)別的序列是對(duì)稱(chēng)的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補(bǔ)鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個(gè)方向閱讀而序列相同的序列稱(chēng)為回紋對(duì)稱(chēng)序列(palindrome)。7制作：王洪剛李斯深二限制性?xún)?nèi)切核酸酶

8制作：王洪剛李斯深二限制性?xún)?nèi)切核酸酶

9制作：王洪剛李斯深10制作：王洪剛李斯深三載體

一個(gè)DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構(gòu)成重組DNA后，在載體DNA的運(yùn)載下，才可以高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞(hostcell)，并在其中復(fù)制、擴(kuò)增、克隆出多個(gè)拷貝。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。作為載體DNA分子，需要具備以下四個(gè)條件：★具復(fù)制原點(diǎn)(ori)，在宿主細(xì)胞中不僅能獨(dú)立地自我復(fù)制，而且能帶動(dòng)攜帶的外源DNA片段一起復(fù)制，★具有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite,MCS)，而每一種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)，用于克隆外源DNA片段。這些酶切位點(diǎn)不存在于復(fù)制原點(diǎn)或抗性選擇標(biāo)記基因內(nèi)。★至少具有一個(gè)選擇標(biāo)記基因，使有或無(wú)載體的宿主細(xì)胞具有易鑒別的表型。★易從宿主細(xì)胞中回收。

11制作：王洪剛李斯深1.細(xì)菌質(zhì)粒◆質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。☆這些質(zhì)粒的適應(yīng)范圍廣，拷貝數(shù)多。進(jìn)入宿主細(xì)胞復(fù)制后，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)粒拷貝數(shù)可高達(dá)1000個(gè)。◆早期用于基因工程的載體是經(jīng)遺傳改良的細(xì)菌質(zhì)粒，它們僅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。☆現(xiàn)在廣泛使用且商品化的質(zhì)粒，很多都具有重組表型檢測(cè)標(biāo)記，在DNA克隆中根據(jù)宿主細(xì)胞的表型即可推知質(zhì)粒是否攜帶外源DNA片段。12制作：王洪剛李斯深2.λ噬菌體

◆λ噬菌體基因組全長(zhǎng)49kb。λ噬菌體DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，位于兩端的為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，在基因庫(kù)篩選中，λ噬菌體作載體與細(xì)菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽(yáng)性克隆數(shù)多等特點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于各類(lèi)基因庫(kù)的構(gòu)建。

13制作：王洪剛李斯深3.柯斯質(zhì)粒

◆柯斯質(zhì)粒(cosmid)是利用部分λ噬菌體DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列組建而成的(圖9－5)。柯斯質(zhì)粒具有λ噬菌體的cos序列(12bp)和細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)。cos序列是噬菌體DNA包裝成噬菌體時(shí)所必需的，而質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)可使柯斯質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中同普通細(xì)菌質(zhì)粒一樣自主復(fù)制。柯斯質(zhì)粒也具有抗生素抗性基因◆可接受長(zhǎng)達(dá)50kb的外源DNA片段，這在克隆真核生物基因中十分有用，因?yàn)橐粋€(gè)DNA片段就可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。還與YAC克隆系統(tǒng)結(jié)合，用于基因作圖分析。14制作：王洪剛李斯深4.穿梭載體

◆穿梭載體(shuttlevectors)是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如既能在原核生物(如大腸桿菌)中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體。因此，這類(lèi)載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列(Autonomouslyreplicatingsequence,ARS)以及選擇標(biāo)記性狀，具有多克隆位點(diǎn)。通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。

15制作：王洪剛李斯深5.細(xì)菌人工染色體

◆

BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制的質(zhì)粒，約100kb，它能在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1000kb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，尤其是重復(fù)序列多的DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，如由小F質(zhì)粒構(gòu)建的載體pBeloBAC11全長(zhǎng)7.4kb(圖9－7)，僅帶有自我復(fù)制、控制拷貝數(shù)(repE)及質(zhì)粒分配(parE，parA,parB)所必須的最少序列。BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)，還有T7及SP6啟動(dòng)子位點(diǎn)，用于制備RNA分子，進(jìn)一步分析克隆的基因表達(dá)，作為染色體步行的探針，以及序列測(cè)定克隆的片段。16制作：王洪剛李斯深17制作：王洪剛李斯深6.酵母人工染色體◆酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）是另一類(lèi)酵母穿梭載體。同YEp載體一樣具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點(diǎn)。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類(lèi)基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類(lèi)人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。18制作：王洪剛李斯深7.Ti質(zhì)粒及其衍生載體

◆Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒(圖9－9)，它自然存在于一種革蘭氏陰菌——土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞中。土壤農(nóng)桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤(growngalltumors)。◆根瘤細(xì)胞的形成是因?yàn)橥寥擂r(nóng)桿菌中存在著一種誘導(dǎo)瘤細(xì)胞(tumor-inducing,Ti)的質(zhì)粒，這種質(zhì)粒被稱(chēng)為T(mén)i質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA,T-DNA)，當(dāng)T-DNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出根瘤，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿(opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和氮源19制作：王洪剛李斯深◆Ti質(zhì)粒具有五個(gè)主要功能區(qū)域(圖9－9)，它們分別是T-DNA、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移(plasmidtransfer)、冠癭堿代謝(opinecatabolism)、復(fù)制原點(diǎn)(ori)和毒性區(qū)域(vir)。◆

T-DNA中直接參與轉(zhuǎn)移并整合到植物染色體上的序列，僅是T-DNA兩端與其它序列交界處的25bp不完全直接重復(fù)(imperfectdirectrepeats)，右端的序列稱(chēng)為右界(rightborder,RB),左端的為左界(leftborder,LB)。T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將其它序列插入到這個(gè)區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組。◆Vir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的。Ti質(zhì)粒是約200-500kb的環(huán)狀DNA分子，很難用作DNA克隆載體進(jìn)行操作

Ti質(zhì)粒特點(diǎn)

20制作：王洪剛李斯深四基因的分離與鑒定(一)從基因庫(kù)中分離基因(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因(三)人工合成基因

21制作：王洪剛李斯深構(gòu)建基因庫(kù)基因庫(kù)(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫(kù)中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫(kù)。只有利用合乎要求的基因庫(kù)才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學(xué)工作才能繼續(xù)深入下去。核基因庫(kù)

◆核基因庫(kù)(genomiclibrary或genomicbank)是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。

◆通常的方法是，盡量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度(大于15kb)的DNA片段，與適宜的載體(如EMBL)連接構(gòu)成重組DNA分子,根據(jù)所用的載體，選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。載體可以是質(zhì)粒，噬菌體或cosmid，BAC或YAC等(一)從基因庫(kù)中分離基因

22制作：王洪剛李斯深◆理想的核基因庫(kù)應(yīng)當(dāng)能包括全部的基因組序列。如果每一個(gè)克隆包括的DNA片段大，則總克隆數(shù)目少，因此，構(gòu)建核基因庫(kù)時(shí)常要選擇能接受較大片段的載體。◆檢測(cè)構(gòu)建的核基因庫(kù)是否包括一個(gè)完整的基因組序列，可用下面的公式計(jì)算：

◆例如人類(lèi)基因組DNA分子量為3.0x106kb,以λEMBL作載體，插入片段的平均長(zhǎng)度為17kb，P為99%時(shí)構(gòu)建的基因庫(kù)應(yīng)有8.1x105個(gè)

重組噬菌體。構(gòu)建基因庫(kù)——（1）核基因庫(kù)23制作：王洪剛李斯深(2)染色體基因庫(kù)

◆將基因組的一部分（如一條染色體）用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)，對(duì)于選擇特異基因及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織十分有價(jià)值。◆例如果蠅X染色體上的一個(gè)片段，具有50多個(gè)多線(xiàn)染色體帶(polytene)，利用微切割技術(shù)將這一段染色體切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌體上構(gòu)建成染色體片段基因庫(kù)。◆在人類(lèi)基因組項(xiàng)目研究中，利用流動(dòng)細(xì)胞分揀技術(shù)(flowcytometry)將人類(lèi)染色體分開(kāi)后，用于構(gòu)建單個(gè)染色體基因庫(kù)，大大加速了人類(lèi)基因組作圖和分析。◆在酵母菌中，利用一種改良的脈沖電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)方法，將酵母菌的16根染色體據(jù)其分子量大小分開(kāi)后，用于構(gòu)建染色體庫(kù)。24制作：王洪剛李斯深(3)cDNA庫(kù)

◆cDNA庫(kù)是以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)合成互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)構(gòu)建的基因庫(kù)。◆絕大多數(shù)真核生物mRNA的3′端具有一段多聚A(poly-A)尾端序列。利用一段多聚T(poly-T)為引物(primer)，與poly-A互補(bǔ)配對(duì)，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，用poly-T引物引導(dǎo)合成一條互補(bǔ)DNA，即第一條DNA鏈，結(jié)果形成RNA-DNA雜合雙鏈(圖9－10)。然后合成第2條鏈。◆對(duì)沒(méi)有poly-A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸(hexamer)為引物合成第一條鏈，再用上述方法得到雙鏈DNA。25制作：王洪剛李斯深◆得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補(bǔ)齊后，以與帶有限制性酶切點(diǎn)的人工接頭連接，酶切后與載體(通常是λ噬菌體)連接，再制備cDNA庫(kù)。◆

cDNA庫(kù)僅具有用于分離mRNA的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因的mRNA序列，所以它僅包括基因組的部分基因序列。◆在實(shí)際工作中，構(gòu)建什么樣的基因庫(kù)取決于研究目的。cDNA庫(kù)對(duì)于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。如果要分離在某一細(xì)胞或組織高效表達(dá)的某種基因，可用該細(xì)胞或組織的mRNA構(gòu)建cDNA庫(kù)，則很容易得到這個(gè)基因。◆通常是將cDNA庫(kù)與核基因庫(kù)配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。(3)cDNA庫(kù)

26制作：王洪剛李斯深2.篩選基因庫(kù)

◆從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件。◆大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫(kù)。◆如菌斑雜交法(plaquehybridization)篩選λ噬菌體核基因庫(kù)。27制作：王洪剛李斯深◆將經(jīng)重組噬菌體(來(lái)自構(gòu)建的基因庫(kù))感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量上層培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑。◆再將培養(yǎng)皿中的噬菌斑轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，變性，然后用標(biāo)記的探針(也變性成單鏈)與膜上的噬菌體DNA雜交，雜交膜用X-光片放射自顯影，檢測(cè)雜交信號(hào)。◆凡是與探針雜交的噬菌斑即為陽(yáng)性克隆。根據(jù)雜交信號(hào)在膜上的相對(duì)位置，定位找出培養(yǎng)皿中所對(duì)應(yīng)的噬菌斑，挑出、培養(yǎng)陽(yáng)性噬菌斑，制備DNA，用作進(jìn)一步分析。菌斑雜交法篩選λ噬菌體核基因庫(kù)28制作：王洪剛李斯深3.陽(yáng)性克隆的分析與鑒定（1）限制性酶圖譜◆構(gòu)建陽(yáng)性克隆的限制性酶圖譜常是分析陽(yáng)性克隆的第一步。根據(jù)同源性分析，可以了解陽(yáng)性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對(duì)位置，用于進(jìn)一步亞克隆(subcloning)或同已知的其它序列比較。◆一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建方法。★實(shí)驗(yàn)過(guò)程：首先將陽(yáng)性克隆DNA分裝在3個(gè)管中，分別用不同的酶及酶的組合酶切DNA。酶切的產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，染色，在紫外燈下就可見(jiàn)到DNA帶。各條帶的分子量大小可根據(jù)分子量標(biāo)記估測(cè)。29制作：王洪剛李斯深★結(jié)果分析●從凝膠電泳結(jié)果可見(jiàn)，用NotⅠ酶切產(chǎn)生二條帶，用SalⅠ酶切也產(chǎn)生二條帶。根據(jù)模式Ⅱ預(yù)計(jì)的三個(gè)片段長(zhǎng)度與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此模式Ⅱ就是這個(gè)15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜。●采用類(lèi)似的方法，將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長(zhǎng)度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，來(lái)分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標(biāo)記進(jìn)行基因組圖譜分析。（1）限制性酶圖譜

30制作：王洪剛李斯深◆采用類(lèi)似的方法，可將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長(zhǎng)度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，來(lái)分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標(biāo)記進(jìn)行基因組圖譜分析。◆此外，上述經(jīng)NotⅠ或SalⅠ消化的片段，可以亞克隆到pUC18等質(zhì)粒上，進(jìn)一步用于限制性圖譜分析或序列測(cè)定。（1）限制性酶圖譜31制作：王洪剛李斯深（2）核酸分子雜交——Southern雜交(Southernblotting)◆將DNA用限制性酶酶切→酶切DNA電泳→變性→轉(zhuǎn)移到膜上→經(jīng)過(guò)標(biāo)記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交→洗去膜上非特異性結(jié)合的探針→檢測(cè)雜交信號(hào)。◆如果轉(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會(huì)檢測(cè)到雜交帶信號(hào)。在篩選基因庫(kù)得到陽(yáng)性克隆后，往往是將限制性酶酶切與Southern雜交結(jié)合起來(lái)，繪制限制性酶圖譜。◆SOUTHERN.EXE32制作：王洪剛李斯深（2）核酸分子雜交——Southern雜交(Southernblotting)33制作：王洪剛李斯深（4）核酸序列分析◆測(cè)定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，還要用計(jì)算機(jī)軟件或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析，才能最后得出結(jié)論。●同源性比較。可將測(cè)出的核酸序列同雜交的探針序列進(jìn)行比較，或?qū)⒌玫降男蛄邪l(fā)到BLAST等DNAData庫(kù)的網(wǎng)址上比較，明確測(cè)得的序列與所有的已知序列之間的同源程度。●分析核酸序列的閱讀框架。一個(gè)ORF就是一段能編碼一條多肽鏈，并通常具有翻譯起始信號(hào)以及一種終止信號(hào)的核苷酸序列。◆對(duì)于那些同已知序列無(wú)任何同源性的新序列，可能還要進(jìn)行基因功能性研究。34制作：王洪剛李斯深(二)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因

◆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是體外快速擴(kuò)增DNA的方法。

◆

PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：

●變性：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。

●復(fù)性：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-60℃

●延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互補(bǔ)鏈

◆

這三個(gè)步驟稱(chēng)為一個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-35個(gè)循環(huán)。◆PCR.EXE35制作：王洪剛李斯深36制作：王洪剛李斯深(三)人工合成基因

◆根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來(lái)，可以很快地人工合成基因。◆例如，首先化學(xué)合成多個(gè)含有80-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸之間具有19-24個(gè)核苷酸的重疊序列(圖9－16)，再將各個(gè)寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個(gè)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出DNA片段。若將兩個(gè)DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段。37制作：王洪剛李斯深38制作：王洪剛李斯深目的基因與載體連接(DNA分子重組)39制作：王洪剛李斯深DNA分子重組40制作：王洪剛李斯深目的基因?qū)胧荏w41制作：王洪剛李斯深五基因工程的應(yīng)用

(一)基因工程工業(yè)◆在動(dòng)物體內(nèi)胰島素是胰腺細(xì)胞先形成一種前體胰島素，再加工成兩條不同的成熟胰島素原分子，A鏈含21個(gè)氨基酸殘基，B鏈含30個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)兩對(duì)二硫鍵連接形成成熟的胰島素。42制作：王洪剛李斯深(二)植物基因工程1.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化◆植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的過(guò)程。◆根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化◆除草劑glyphosate，是通過(guò)抑制葉綠體中的EPSP合成酶而殺死雜草的。如果EPSP合成酶遭到glyphosate的破壞，會(huì)使一些關(guān)鍵氨基酸的合成受阻，導(dǎo)致植物枯萎、死亡◆利用從抗glyphosate的大腸桿菌中分離、克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草劑glyphosate轉(zhuǎn)基因植物。43制作：王洪剛李斯深2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)◆通過(guò)高壓氣體等動(dòng)力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒，將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，并整合到染色體上的方法。◆這種轉(zhuǎn)化方法已廣泛用于轉(zhuǎn)化水稻、小麥、玉米、大豆等主要作物。基因槍技術(shù)還用于轉(zhuǎn)化微生物、動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)植物器官、細(xì)胞器和正在生長(zhǎng)的植物。另外，基因槍在多基因共轉(zhuǎn)化中更表現(xiàn)出極大的優(yōu)越性。44制作：王洪剛李斯深(三)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展要慢一些。

◆例如，利用轉(zhuǎn)基因羊大量表達(dá)人類(lèi)的抗胰蛋白酶。人類(lèi)抗胰蛋白酶基因缺失導(dǎo)致的肺氣腫，屬于一種先天性遺傳疾病。◆將人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶產(chǎn)生相關(guān)基因啟動(dòng)子的下游，這種啟動(dòng)子僅在乳腺細(xì)胞中表達(dá)。將這個(gè)嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊體內(nèi)，產(chǎn)下的轉(zhuǎn)基因羊發(fā)育正常。交配后產(chǎn)生的羊奶中含有大量有功能的人類(lèi)抗胰蛋白酶(每升35克)，這一結(jié)果說(shuō)明可利用家禽作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)人類(lèi)大量需要的重要蛋白質(zhì)。45制作：王洪剛李斯深(四)遺傳疾病診斷RFLP法

RFLP法46制作：王洪剛李斯深(四)遺傳疾病診斷2.等位基因特異寡核苷酸法47制作：王洪剛李斯深(五)基因治療◆利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系骄哂羞z傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病的方法，通常叫做基因治療(genetherapy)。◆目前已有幾種基因治療方法。其中最常用的基因轉(zhuǎn)移治療方法是利用減毒的病毒DNA(retrovirusDNA)作載體，構(gòu)建重組DNA分子，用病毒包裝物包裝后形成的重組減毒病毒感染患者的細(xì)胞，將正常基因整合到染色體上。48制作：王洪剛李斯深(六)DNA芯片

◆DNA芯片技術(shù)是在面積不大(如2平方厘米)的基片表面分成不同小格，有序地點(diǎn)陣排列一系列固定于一定位置的、可尋址的核苷酸分子，再將待分析的核苷酸分子標(biāo)記(如用熒光)，變性成單鏈后與芯片進(jìn)行分子雜交，與芯片上序列相同的核苷酸將與其雜交，與芯片上序列不同的序列就會(huì)被洗掉，然后用高精度的激光掃描儀記錄分子雜交的熒光信號(hào)，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析、綜合成可讀的信息。因此，DNA芯片分析同核酸分子雜交一樣，得到的信息是核苷酸水平的遺傳變異資料。Chip.ppt

49制作：王洪剛李斯深第二節(jié)基因組學(xué)

◆基因組學(xué)(genomics)是遺傳學(xué)研究進(jìn)入分子水平后發(fā)展起來(lái)的一個(gè)分支，主要研究生物體全基因組(genome)的分子特征。◆基因組學(xué)強(qiáng)調(diào)的是以基因組為單位，而不是以單個(gè)基因?yàn)閱挝蛔鳛檠芯繉?duì)象，因此，基因組學(xué)的研究目標(biāo)是認(rèn)識(shí)基因組的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化，弄清基因組包含的遺傳物質(zhì)的全部信息及相互關(guān)系，為最終充分合理地利用各種有效資源，為預(yù)防和治療人類(lèi)遺傳疾病提供科學(xué)依據(jù)。50制作：王洪剛李斯深第二節(jié)基因組學(xué)51制作：王洪剛李斯深基因組學(xué)的重要組成部分是基因組計(jì)劃(genomeproject)，大體上可分為：◆構(gòu)建基因組的遺傳圖譜(geneticmap)；◆構(gòu)建基因組的物理圖譜(physicalmap)；◆測(cè)定基因組DNA的全部序列；◆構(gòu)建基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；◆分析基因組的功能。

第二節(jié)基因組學(xué)52制作：王洪剛李斯深◆人類(lèi)基因組計(jì)劃”(humangenomeproject，HGP)：1996年，構(gòu)建了每個(gè)標(biāo)記的密度為0.6Mb(1Mb=一百萬(wàn)個(gè)堿基)的人類(lèi)基因組遺傳圖譜，0.1Mb的物理圖譜。2000年完成了人類(lèi)基因組草圖的構(gòu)建，并已測(cè)定基因組的大量核苷酸序列。◆水稻基因組計(jì)劃(ricegenomeproject，RGP)◆模式生物如酵母、線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥基因組計(jì)劃第二節(jié)基因組學(xué)53制作：王洪剛李斯深第二節(jié)基因組學(xué)基因組圖譜的構(gòu)建基因組圖譜的應(yīng)用

后基因組學(xué)

54制作：王洪剛李斯深一基因組圖譜的構(gòu)建鳥(niǎo)槍射擊法(shotgun)基因組序列測(cè)定55制作：王洪剛李斯深在進(jìn)行大規(guī)模序列測(cè)定之前，構(gòu)建基因組圖譜是測(cè)定大基因組全部核苷酸序列的重要一環(huán)。基因組圖譜可作為序列測(cè)定中制定測(cè)序方案的依據(jù)，以便先重后輕地分析基因。有了基因組圖譜之后，基因組序列測(cè)定可用下列兩種方法結(jié)合進(jìn)行：◆克隆連續(xù)序列法(clonecontig)，將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0.1Mb-1Mb的大片段，克隆到Y(jié)AC或BAC載體上，分別測(cè)定單個(gè)克隆的序列，再裝配、連接成連續(xù)的DNA分子。◆定向鳥(niǎo)槍射擊法(directedshotgun)，以基因組圖譜中的標(biāo)記為依據(jù)，測(cè)序、裝配和構(gòu)建不同DNA片段的序列。一基因組圖譜的構(gòu)建

(一)遺傳圖譜的構(gòu)建(二)物理圖譜的構(gòu)建56制作：王洪剛李斯深(一)遺傳圖譜的構(gòu)建

1.圖譜標(biāo)記圖譜構(gòu)建中需要可以鑒別的標(biāo)記(marker)，在構(gòu)建遺傳圖譜中，可用基因和DNA作為標(biāo)記。(1)基因標(biāo)記

基因控制性狀的表現(xiàn)，所以也就是利用可以鑒別的形態(tài)、生化等表型性狀作標(biāo)記，這與前述的連鎖交換中介紹的方法一樣。遺傳學(xué)中最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的一些基因作為標(biāo)記，分析各基因間的連鎖關(guān)系及