來自GeneCopoeia的慢病毒顆粒制備和應用GeneCopoeiaTM

4006020200唐珍潔zhenjietang@GeneCopoeiaInc.

日本Riken：

2004年1月-4月，為Riken提供1600個人類基因克隆構建。Roche：2006年4月-2007年3月，合作完成13000個人類基因克隆的無細胞體系蛋白表達。NCBI：2009年成為NCBI推薦克隆供應商。中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院：2006年5月至今，慢病毒載體和哺乳動物載體干細胞相關基因表達克隆構建，華南地區特種疾病相關胚胎干細胞庫的建立。美國NIH（美國國家衛生研究院）：2007年7月-2008年1月，3000個斑馬魚克隆構建。美國Novartis（美國諾華制藥）：2009年10月，美國諾華制藥簽約長期基因克隆供應商。2021/9/302生命奧秘電子雜志2008年創刊，現已出版45期，擁有近30萬名讀者。一直關注最前沿資訊，關注內容包括疾病療法、基因、蛋白、前沿技術等。2021/9/303誘導性多能干細胞腫瘤轉移RNAimicroRNA&癌癥染色質與干細胞分化p53細胞信號通路GFP基因調控人類基因組測序40年抗癌歷程回顧蛋白動力學表觀基因組蛋白質泛素化人類蛋白質相互作用生物標志物新型蛋白標簽數量遺傳學疫苗安全與研發展望新型疫苗載體睡眠機制丙型肝炎抗腫瘤血管生成療法蛋白激酶與心血管疾病HIV個性化用藥人類基因療法新一代DNA測序技術iPS技術光遺傳學技術海量生物學生物信息學在癌癥研究中的應用《核酸研究》生物數據庫進展合成生物學轉化醫學組織工程與再生醫學2021/9/304Outline體細胞定向重編程的研究思路慢病毒的構建原理慢病毒顆粒制備方法及應用2021/9/305ApplicationoflentivirusinsomaticreprogrammingVierbuchenT,etal.(2010)Directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.Nature463:1035-1041LijianH,etal.(2011)Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.Nature475:386-389EdwardE.M,etal.(2011)HighlyEfficientmiRNA-MediatedReprogrammingofMouseandHumanSomaticCellstoPluripotency.Cellstemcell8:376-3882021/9/306ProtocolofDirectedReprogramming重編程因子的選擇靶細胞的選擇體細胞定向重編程重編程機制研究信號通路探討終末細胞的篩選和鑒定+檢測重編程效率終末細胞的功能指標檢測2021/9/307ProfileDetection---qPCRArray2021/9/308ProfileDetection---miRNAqPCRArray包含有65個miRNAs,可用于檢測干細胞的分化程度,同時也可篩選特異miRNAs用于體細胞重編程研究

http:///product/qpcr/mirna_array/2021/9/309miRNAqPCRValidatedPrimers人、小鼠、大鼠miRNA的Q-PCR引物都通過嚴格的實驗驗證/product/search/index.php?prt=22輸入miRNAname、AccNo或Sequence等即可獲得驗證結果2021/9/3010Expressionofreprogrammingfactors

-------ORFexpressionclone基因的ORF表達克隆有6種表達體系，100多種載體；該克隆可直接用于表達2021/9/3011miRNA表達框已完全測序確證基于慢病毒載體系統的表達克隆可轉染未分化細胞和難轉化的細胞，獲得與普通分化細胞類似的轉染效率通過應用eGFP可以監測病毒和質粒載體的轉染效率Expressionofreprogrammingfactors

-------miRNAclone2021/9/3012Pre-madelenti-vectorexpressionclone已經將約20,000條基因插入到慢病毒載體（Lv105）、哺乳動物載體（M02)等4套載體中，5個工作日即可交付使用。/product/clone/orf_clone_special_collection.php

2021/9/3013GeneGroups/Families/product/search/group/2021/9/3014Reserchofreprogrammingmechanism理解細胞正常的分化機制，可以更準確地運用各種重編程因子進行細胞轉分化的操作。

http:///product/search/pathway/

2021/9/3015Reserchofreprogrammingmechanism2021/9/3016VirusvectorAdenovirusAAVLentivirusRetrovirusGeneExpressionTransientTransientorStableTransientorStableStableInfectDividingCellsYesYesYesYesInfectNon-DividingCellsYesYesYesNoIntegrationintoTargetCellGenomeNoNo*YesYesImmuneResponseinTargetCellsHighVeryLowLowModerateRelativeViralTiterXXXXXXXXXXXXRelativeTransductionEfficiencyXXXXXXXXXXXX*NativeAAVwillintegrate,butrecombinantAAVrarelydoes.2021/9/3017HIVViron慢病毒載體（LentiviralVector）主要是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展起來的基因轉移載體。2021/9/3018HIV&replication2021/9/3019Packagingmix

----------fourplasmidssystemCMVgagpolRREpolyAEF1αREVpolyACMVpolyAVSV-G包膜蛋白質粒包裝質粒+2021/9/3020MammalianConstitutivepromotersQinJY,etal.(2010)SystematicComparisonofConstitutivePromotersandtheDoxycycline-InduciblePromoter.PLoSONE5(5):e106112021/9/3021PackagingsystemP2021/9/3022LentiparticlePackagingPlate293Tcellsfortransfection.Prepareplasmidmix+EndoFectinAddto293TcellsChangeMediumHarvestmedium(Viruses)LentivirustitrationLentiviruspurificationandconcentration.(optional)StoreLentivirusesinsingleusealiquotat-80°CDay1Day2Day4Day4-724-48hours20-30min4-6h48-72hoursaftertransfection2021/9/3023PackagingTransfection48hours1-100ms-48h2-100ms-48h3-100ms-48h2021/9/3024TitrationoftheLentivirusesFlorescentcolonycountingorFACScounting:Infectionunits(IU/ml)Resistantcolonycounting:Infectionunits(IU/ml)RT-qPCR:copynumberofthevirus,nottheinfectionunitCellsforLentivirustitration:Hela,HT1080,orH1299cells2021/9/3025TitrationoftheLentivirusin24-wellplates1--2.5x107U/ml2--1.8x107U/ml3--3.5x107U/ml0.1ul1--2.5x107U/ml1.0ul2--1.8x107U/ml3--3.5x107U/ml將慢病毒顆粒稀釋成不同濃度(0.02,0.1,1.0and5.0ul)轉染細胞48~72h后，在熒光顯微鏡下計數滴度=感染細胞數*病毒顆粒劑量2021/9/3026TitrationoftheLentivirusesFlorescentcolonycountingorFACScounting:Infectionunits(IU/ml)Resistantcolonycounting:Infectionunits(IU/ml)RT-qPCR:

copynumberofthevirus,nottheinfectionunitCellsforLentivirustitration:Hela,HT1080,orH1299cells2021/9/3027PurificationandConcentrationofLentiviruses1.TraditionalCsClultracentrifugation.3.Ionexchange:

ViraBind?Concentration&PurificationKits(CellBiolabs);Fast-TrapVirusPurificationandConcentrationKits(Millipore).4.Precipitation:

LentiPacTMLentivirusConcentrator(GeneCopoeia).Quickandsimpleconcentrationoflentiviralparticles(2-3hours).Increasetiter(IU/ml)by10X–100X.NoultracentrifugationisrequiredHighrecovery:>90%Pre-step:Filtration(polyethersulfone(PES)filters)orgeneralcentrifugation.

2.Ultrafiltration:usingfilter<0.01μM(200KD)2021/9/3028PurificationandConcentrationofLentiviruses(Cont.)A.Pre0.2ulB.Conc.4h0.02ulC.Conc.16h0.02ulFigure.ConcentrationofLentiviruses:GFPcontaininglentiviruses(2x107IU/ml)wereconcentrated10timesusingLentiDensandthentransducedtheH1299cellsin24-wellplates.Theimagesweretaken48