溫度對溫泉中古細菌多樣性的影響

0古細菌群落的組成長期以來，古細菌的一些奇怪習慣和潛在生物研發的前景引起了人們的關注。1990年Woese提出了“三域分類學說”,即將生物界分為真核生物(Eucaryota)、真細菌(Bacteria)和古細菌(Archaea)三域。在rRNA進化樹上,古細菌可分為泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)以及未確定的初古菌門(Korarchaeota)和納古菌門(Nanoarchaeota),其中研究相對深入的是泉古菌門和廣古菌門。目前自然界中已知的可培養微生物僅占0.1%～10%,即便是得到了純培養,其形態和生理也可能發生很多變化。因此,分子生物學技術已成為研究微生物生態學行之有效的方法,為揭示自然環境微生物多樣性提供了一條新的途徑。古細菌域的分子生態學分析顯示許多未培養的古細菌主要分布在陸地溫泉、淡水湖泊、沿海或深海水域、海底沉積物或熱溢口以及土壤環境等。我國是個溫泉資源豐富的國家,總體上看,主要分布在西藏、云南、廣東、福建、四川以及東部的臺灣省等地區,在華北燕山山區也出露有近30個溫泉,這為我們開展溫泉古細菌多樣性的研究提供了豐富和寶貴的資源。目前學者們對溫泉微生物生態學的研究主要集中在高溫和超高溫環境中,對中低溫環境的研究還相對較少。國際上對陸地溫(熱)泉高溫菌研究比較深入的主要是美國黃石國家公園溫泉,以及冰島和日本的一些高溫溫泉,而國內對云南騰沖熱海的溫泉研究開展較早,也較為系統,但對華北地區的溫泉研究甚少。本研究組前期曾對華北承德地區溫泉中細菌的多樣性水平進行了初步研究,發現其細菌群落結構與其他地區的溫泉相比存在一定的差異,而且其中的某些菌種還可以通過自身的代謝來影響溫泉泉華的形成,證明該地區溫泉中細菌群落的組成較為特殊。但承德地區溫泉中古細菌群落的組成是什么?它們在溫泉生態系統中扮演著什么角色,是否和細菌群落有相互作用?目前還未見相關報道。本研究通過構建古細菌的16SrDNA克隆文庫,對我國華北承德地區兩個不同溫度的溫泉(61.4℃和74.5℃)中古細菌的多樣性及系統發育關系進行了分析,研究結果可為該地區溫泉生態系統的進一步深入研究提供可靠的依據。1材料和方法1.1水質、水資源量樣品采集于2010年6月28—29日,采樣地點為河北承德地區兩個不同溫度的溫泉:圍場縣山灣子溫泉(A12)和隆化縣七家溫泉(A14)。山灣子溫泉出露于河谷中部,來自下部花崗巖破碎帶的熱水穿過淺部第四系沉積物而涌出地面。七家溫泉的出露受到北東向斷裂控制,現地表已沒有泉眼,由鉆孔在原泉眼處抽取地下熱水。水樣采集后裝于無菌瓶中,儲存于4℃保溫箱中,盡快返回實驗室進行操作。溫度、pH、高程等參數現場測定(表1),其他物理化學參數測定由北京市地質工程勘察院實驗室完成。1.2總dna的提取取1L水樣于孔徑為0.22μm的細菌濾膜上進行真空抽濾,將濾膜浸泡于10mL無菌生理鹽水中,超聲波振蕩10min,然后用移液槍反復吹打使膜上細胞完全進入溶液中。使用離心機10000r/min離心3min收集菌體。用環境基因組DNA提取試劑盒提取水樣中的總DNA(參照MPBio試劑盒說明書),提取產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。最后將提取的總DNA置于-20℃下保存。1.3相關基因片段的pcr擴增以基因組DNA為模板,使用古細菌通用引物對ARC21F(5′-TTCYGGTTGATCCYGCCRGA-3′)和ARC968F(5′-YCCGGCGTTGAMTCCAWTT-3′),PCR擴增樣品中的相應基因片段。PCR擴增程序為:95℃預變性5min,94℃變性30s,52℃退火30s和72℃延伸1min,共35個循環,最后在72℃下延伸7min。PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。1.4pcr擴增篩選將PCR產物通過克隆試劑盒連接到pEASY-T1克隆載體上,并熱激轉化到Trans1-T1感受態細胞中,然后涂布在含有Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上,于37℃下靜置培養16h。隨機挑取白色克隆,重新純化培養,并用特異性引物對M13M4(5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13RV(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)進行PCR擴增篩選插入片段。最后將鑒定出的陽性克隆送交中科希林生物科技有限責任公司完成測序。1.5序列篩選、系統發育樹構建運用Bellerophon程序對獲得的序列進行嵌合體的檢驗,刪除嵌合體后用Dotur軟件對剩余序列進行分類,最后運用BLAST程序將各類序列在GenBank數據庫中進行相似性搜索,并下載相似性最高的序列和相似性較高的已知種的序列作為參考。將所有序列用BioEdit中的ClustalW程序進行處理后,用MEGA4.0軟件構建系統發育樹。本研究所得序列均已提交GenBank,序列登錄號為JF830106-JF830119。2結果2.1不同強化項目的熱泉比較根據《飲用天然礦泉水檢驗方法》(GB/T8538—2008),對山灣子溫泉(A12)和七家溫泉(A14)兩個熱泉中的鉀、鈉、鈣、鎂等34個項目進行分析,表1列出了部分實驗結果。2.2dna片段大小及含量兩個環境的樣品總DNA的提取結果如圖1所示,其中1為A12,2為A14。所提DNA的片段大小均約為23kb,表明已獲得較為完整的基因組DNA。并且A260/280比值在1.83左右,說明DNA的純度較高,可以直接用于PCR。2.31不同濃度模板pcr產物的表達兩溫泉樣品中古細菌的16SrDNA基因片段擴增結果如圖2所示。泳道1-1和1-2為A12加不同濃度模板后的PCR產物,2-1和2-2為A14加不同濃度模板后的PCR產物,CK為陰性對照。由圖可知,兩樣品用古細菌通用引物對(ARC21F/ARC968F)進行PCR擴增均可以獲得單一的目的條帶,片段長度約900bp,無明顯非特異性擴增現象出現。2.4建立克隆信息庫兩熱泉樣品的擴增產物經連接轉化后,各隨機挑取50個白色克隆建立克隆文庫。用特異性引物對M13M4和M13RV進行插入片段篩選后,將鑒定出的陽性克隆進行測序,兩個樣品共得到78個序列。2.5強化、分類、序列及系統發育樹運用Bellerophon程序檢驗并去除嵌合體后,將剩余序列通過Dotur軟件進行分類,并繪制兩文庫的飽和曲線(圖3)。從圖3看出,最終可將獲得的古細菌16SrDNA序列分成13種基因型(A12為3種,A14為10種),兩文庫分析均趨于飽和。將每種基因型的代表序列輸入RDP網站,用Classifier程序確定其系統發育類群,結果表明(圖4):A12(74.5℃)文庫中16SrDNA序列分屬3個類群,分別為Crenarchaeota(33.3%)、Euryarchaeota(62.5%)、UnclassifiedArchaea(4.2%)。A14(61.4℃)文庫中的16SrDNA序列則分屬2個類群:Crenarchaeota(88.5%)和UnclassifiedArchaea(11.5%),并沒有廣古菌門(Euryarchaeota)微生物的分布。由此可見,兩熱泉的優勢種群不同,廣古菌門(Euryarchaeota)是樣品A12的優勢類群,而泉古菌門(Crenarchaeota)是A14的優勢類群。將每種基因型的序列輸入NCBI網站,用BLAST程序在GenBank數據庫中進行相似性比對,結果如表2所示。從表2中可以看出,七家溫泉A14(61.4℃)的基因型種類遠遠高于山灣子溫泉A12(74.5℃),表明溫度是影響溫泉中古細菌多樣性水平的關鍵因素。通過BLAST比對發現,文庫中序列與許多類似環境中的古細菌和環境克隆密切相關,如:A12-11(MethanosaetathermophilaPT)、A14-16(CandidatusNitrososphaeragargensis)、A14-22(CandidatusNitrosocaldusyellowstoniistrainHL72)、A14-31(Crenarchaeotalsp.clonepJP41)。其中,MethanosaetathermophilaPT是嗜熱產甲烷古細菌,而CandidatusNitrososphaeragargensis和CandidatusNitrosocaldusyellowstoniistrainHL72是與氨氧化作用密切相關的古細菌。為了進一步了解這些古細菌的系統發育地位,除了數據庫中同源性最高的序列之外,本研究還下載了一些同源性較高的已知菌種的序列,與所得序列構建了A12和A14兩個溫泉樣品中古細菌類群的系統發育樹(圖5)。下面分別描述主要類群代表克隆的系統發育關系。(1)Crenarchaeota泉古菌門是古細菌的一個大分支,包括很多極端嗜熱微生物。該類古細菌是A14(61.4℃)文庫中的優勢類群,占88.5%。包括8種基因型,而且這8個克隆均屬于分類地位相對明確的熱變形菌綱(Thermoprotei)。其中,克隆A14-1在A14文庫中所占比例為37.2%,是該文庫中最豐富的序列類型,它與UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.的相似性達96%。UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.是Nunoura等從日本Hishikari金礦的地下熱水(60～70℃)中,利用宏基因組的方法推斷出來的未培養微生物。該古細菌基因組含有一個16S/23SrRNA操縱子和44個編碼蛋白的基因。UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.可能在地下熱水的硝化過程中起著重要的作用。A14-22在A14文庫中所占比例為34.3%,是該樣品的第二豐富的基因型。通過BLAST比對發現,該克隆與CandidatusNitrosocaldusyellowstonii的親緣關系比較密切,同源性高達99%。CandidatusNitrosocaldusyellowstonii是由Torre等從美國黃石國家公園熱泉沉積物中富集培養出的一株嗜熱硝化古細菌,可以通過好氧氨氧化進行自養生長,并能在高達74℃的熱環境中進行硝化作用。氨氧化古細菌的廣泛分布和多樣性證明其對氮循環的貢獻具有全球性意義,但一直以來發現的氨氧化古菌主要分布在中低溫環境中,因此該菌株的發現大大地擴展了硝化作用的溫度限制,并且證明了氨氧化的能力廣泛分布在泉古菌門中。此外,A14-16與CandidatusNitrososphaeragargensis在系統發育樹聚為一個分枝(圖5)。CandidatusNitrososphaeragargensis是Hatzenpichler等通過富集培養從西伯利亞Garga溫泉中獲得的一株古細菌,該菌株是第一株被描述的嗜熱氨氧化微生物,已在46℃的環境中培養了長達6年的時間。研究表明,該古細菌在中度嗜熱的條件下具有較好的氨氧化性能,在0.14和0.79mM氨濃度時活性最高,但在3.08mM氨濃度時部分被抑制。由于該菌的性質非常特殊,所以有學者建議它應該屬于除泉古菌界和廣古菌界外的另一個新的分類單元Thaumarchaeota。克隆A14-1、A14-10、A14-16和A14-22都與氨氧化作用密切有關,它們在系統發育樹上聚為一個大的分枝(圖5)。該類序列在樣品A14中所占比例高達77.3%。(2)Euryarchaeota廣古菌門包括古細菌的大多數種類,在A12文庫中所占比例高達62.5%,是該樣品中的絕對優勢類群,但在A14文庫中沒有廣古菌門類微生物的分布。此外,A12文庫中的Euryarchaeota都屬于產甲烷鬃毛菌(Methanosaeta),該屬微生物是很多厭氧環境中最主要的產甲烷古菌。主要克隆A12-11與MethanosaetathermophilaPT(嗜熱甲烷鬃毛菌)的同源性達98%,是親緣關系最近的已培養菌種。MethanosaetathermophilaPT最早分離自污泥消化反應器,為革蘭氏陰性桿菌,專性厭氧,最適生長溫度為55～60℃,最適生長pH為7左右,只能利用乙酸進行生長和產甲烷,不能利用H2-CO2、甲酸、甲胺和甲醇進行生長,生長時不需要NaCl。目前,該菌種的全基因組已經獲得了測序。3民宿中細菌和古細菌群落的組成第利用分子生物學方法分析兩熱泉樣品中古細菌的多樣性,結果表明熱泉中古細菌主要分屬泉古菌門(Crenarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota)兩個門。其中Euryarchaeota是山灣子溫泉A12(74.5℃)的優勢類群,而Crenarchaeota是七家溫泉A14(61.4℃)的優勢類群。A14文庫的古細菌多樣性水平明顯比A12高,表明溫度是影響溫泉中古細菌多樣性的重要環境因子。此外,在兩文庫中還存在少量的未分類的古細菌,這些特殊的微生物類群是認識和研究新型古細菌的良好材料。產甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在樣品A12中占統治地位,所占比例高達62.5%。該屬古細菌只能利用乙酸作為碳源生長和產甲烷,它們廣泛分布在厭氧環境中,尤其是各類厭氧反應系統中,例如污泥厭氧消化反應器、固體廢棄物處理系統、UASB反應器和厭氧折流板反應器等。在厭氧反應器的起始階段,因為系統中乙酸濃度較高,所以產甲烷鬃毛菌往往具有很高的數量。但像本研究這樣,產甲烷鬃毛菌在74.5℃的溫泉系統中占統治地位的現象在類似研究中還比較罕見。產生這種特殊現象的主要原因可能是,A12溫泉中細菌和古細菌之間形成了一種特殊的共生關系,細菌在源源不斷地為產甲烷鬃毛菌提供生長所需要的唯一碳源——乙酸。我們在前期研究中發現,在樣品A12的細菌群落中,厭氧芽胞桿菌屬(Anoxybacillus)細菌的比例高達93.5%,占絕對統治地位。該屬細菌在厭氧條件下可以葡萄糖、果糖、海藻糖和淀粉等多種有機物為底物進行發酵代謝,最主要的發酵產物為乙酸和氫氣。此外,樣品A12細菌群落的其他成員均為醋弧菌屬(Acetivibrio)細菌,該屬微生物發酵碳水化合物的主要產物同樣也是乙酸。因此,山灣子溫泉A12中,細菌和古細菌形成了類似厭氧水處理系統中的產氫產乙酸菌和產甲烷菌的共生關系:細菌主要通過厭氧發酵有機物產生乙酸和氫氣,而古細菌主要以細菌產生的乙酸為底物進行生長和產甲烷。正是這種共生關系的存在,才導致產甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在樣品A12中占統治地位。七家溫泉A14的古細菌群落和與山灣子溫泉A12截然不同,該樣品中77.3%的序列與好氧氨氧化作用有關。氨氧化作用是好氧微生物將銨態氮轉化為亞硝酸鹽氮的過程。作為硝化作用的限速步驟,氨氧化作用在氮素生物地球化學循環過程中一直備受關注。長期以來,人們普遍認為Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria中的好氧化能自養氨氧化細菌是氨氧化作用的主要承擔者。然而,隨著近年來微生物分子生態學研究的不斷深入,人們逐漸發現氨氧化古菌廣泛分布在海水、土壤、河口沉積物、珊瑚、海綿以及廢水生物反應器等各種自然和人工環境中。在很多條件下,氨氧化古菌的數量要遠遠高于氨氧化細菌。因此,氨氧化古菌在全球氮素循環中發揮著重要作用。早期人們發現的氨