酶工程

Enzymeengineering

緒論第一章酶的基礎(chǔ)知識第二章酶的發(fā)酵生產(chǎn)第三章酶的分離純化第四章酶的分子修飾與模擬第五章酶和細(xì)胞的固定化第六章酶的非水相催化第七章酶的應(yīng)用第一篇酶理論第二篇酶工程Chapter4ModificationandsimulationofEnzymeMolecule酶的分子修飾與模擬酶分子改造的方向核酸水平：利用基因操作技術(shù)對DNA或mRNA進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶?！锩腹こ虄?nèi)容之一蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對酶的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，這包括酶的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象變得更為穩(wěn)定。另一方面是對酶分子中氨基酸殘基的修飾。即酶的化學(xué)修飾。生物酶工程生物酶工程指酶學(xué)與以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，主要包括：（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）；策略：

先在特定的酶的結(jié)構(gòu)基因前加上高效的啟動基因序列和必要的調(diào)控序列→將此片斷克隆到一定的載體→將帶有特定酶基因的雜交表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)氖荏w（細(xì)菌或酵母）中，通過發(fā)酵方法大量生產(chǎn)所需要的酶（2）對酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶);通過定點誘變技術(shù)，改造編碼酶分子中的DNA順序，經(jīng)過寄主細(xì)胞的表達(dá)，能產(chǎn)生被改造的新酶。這種遺傳修飾，可改變酶的催化活性、底物專一性、最適pH;改變含金屬酶的氧化還原能力；改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)功能；改變酶對輔酶的要求；提高酶的穩(wěn)定性。（3）設(shè)計新的酶基因，合成自然界即不曾有的新酶。酶分子改造的方向核酸水平：利用基因操作技術(shù)對DNA或mRNA進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶?！锩腹こ虄?nèi)容之一蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對酶的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，這包括酶的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象變得更為穩(wěn)定。另一方面是對酶分子中氨基酸殘基的修飾。即酶的化學(xué)修飾。Contentsofchapter4酶的分子修飾與模擬1、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo5、化學(xué)人工模擬酶Go思考題1.酶分子的化學(xué)修飾通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要作用的最適條件不符酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)臨床應(yīng)用的特殊要求酶為什么要進(jìn)行化學(xué)修飾:酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域在基礎(chǔ)酶學(xué)研究上探測酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的測定酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶的固定化技術(shù)酶分子修飾的意義:研究活性中心的方法（1）酶的專一性研究（2）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法（3）X射線晶體衍射法（4）定點誘變法一級結(jié)構(gòu)測定步驟要點：a.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目b.多肽鏈的拆分（包括二硫鍵的斷裂）c.多肽鏈斷裂成多個肽段

d.確定所得每一種小肽段的氨基酸順序

e.鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端殘基f.利用兩套肽段上的重疊部位，進(jìn)行核對拼接，排出整個肽鏈的氨基酸順序。

g.確定二硫鍵的位置基本戰(zhàn)略：片段重疊法＋氨基酸順序直測法多肽鏈的拆分（二硫鍵的斷裂）

方法一SSSSSSHS-CH2-CH2-OHSHSHSHSHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOH多肽鏈的拆分（二硫鍵的斷裂）

方法二：8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下（解離多肽鏈之間的非共價力）；應(yīng)用過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵。ssHCOOOHSO3HSO3H+-+-第二向第一向Brown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中紅色斑點是連二硫鍵的肽段將所得的肽段利用Brown及Hartlay的對角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離SSHCOOOHSO3HSO3H+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段在疾病治療上克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶細(xì)胞在工業(yè)上的應(yīng)用酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域2.酶化學(xué)修飾的基本要求和條件對酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。（1）了解被修飾酶的性質(zhì)（2）選擇修飾反應(yīng)條件（1）了解被修飾酶的性質(zhì)酶的穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及pH，酶蛋白解離時的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。酶活性中心的狀況：包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。2.酶化學(xué)修飾的基本要求和條件（1）了解被修飾酶的性質(zhì)（2）選擇修飾反應(yīng)條件（2）選擇修飾反應(yīng)條件：修飾反應(yīng)應(yīng)盡量在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡量不破壞酶活性必需基團(tuán)，修飾率高，活力回收要高。（2）選擇修飾反應(yīng)條件①pH與離子強(qiáng)度：pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同，其反應(yīng)性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在不同pH下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成不同的產(chǎn)物。離子強(qiáng)度對修飾反應(yīng)也有重要影響。②修飾反應(yīng)的溫度與時間：嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時間可以減少或消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。③反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。（1）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代3.酶分子的化學(xué)修飾方法⑦反相膠團(tuán)微囊化⑥脂質(zhì)體包埋⑤分子間交聯(lián)④分子內(nèi)交聯(lián)③酶的大分子修飾作用②酶的小分子修飾作用①化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾（1）酶的表面修飾①化學(xué)固定化：一般是直接通過酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價連接到惰性載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。②酶的小分子修飾作用：采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基、咪唑基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。酶的小分子修飾作用

對巰基的化學(xué)修飾：

常用的修飾試劑有烷基化劑、?；ⅠR來酰亞胺等。

氨基的化學(xué)修飾：

常用的修飾試劑有乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化試劑、丹磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯（PITC)等。

羧基的化學(xué)修飾：

水溶性羰二亞胺或氨化反應(yīng)、硼氟化三甲烊鹽反應(yīng)、甲醇-鹽酸酯化反應(yīng)等。

咪唑基的修飾反應(yīng)：

焦碳酸二乙酯反應(yīng)、碘代反應(yīng)、碘化反應(yīng)等。

吲哚基的化學(xué)修飾：

2-羥基-5-硝基芐溴、光敏試劑、4-硝基苯硫氯等。甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾：

H2O2、光敏試劑、碘代乙酰胺等二硫鍵的化學(xué)修飾：

2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過甲酸等。酚基的化學(xué)修飾：

N-乙酰咪唑、碘化反應(yīng)、四硝基甲烷、偶氮化試劑、二異丙基氟磷酸。

胍基的化學(xué)修飾：

丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛等。巰基的化學(xué)修飾E（1）DTNB：5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）氨基的化學(xué)修飾三硝基苯磺酸羧基的化學(xué)修飾硼氟化三甲烊鹽咪唑基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾⑦反相膠團(tuán)微囊化⑥脂質(zhì)體包埋⑤分子間交聯(lián)④分子內(nèi)交聯(lián)③酶的大分子修飾作用②酶的小分子修飾作用①化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾糖類的修飾反應(yīng)：右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修飾反應(yīng)：右旋糖苷是由

-葡萄糖通過-1,6-糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其雙羥基經(jīng)過活化后可與酶分子上的游離氨基相結(jié)合。主要的修飾方法有：溴化氰法、高碘酸氧化法。糖肽（Glycopeptide)的修飾反應(yīng):糖肽是由人纖維蛋白或-球蛋白經(jīng)蛋白酶水解后得到的產(chǎn)物，其分子上具有游離氨基，活化后可與酶分子上的氨基反應(yīng)。主要方法有：2,3-異氰酸甲苯活化法、戊二醛法。聚乳糖修飾反應(yīng)：聚乳糖在一定溫度下，通過適當(dāng)?shù)倪€原劑可與酶分子上氨基反應(yīng)。③酶的大分子修飾作用合成大分子多聚物修飾酶聚N-乙烯吡硌烷酮(PVP):用水溶性的分子量為10,000的PVP,經(jīng)過開環(huán)水解,活化后,與酶結(jié)合。聚乙烯醇(PVA):PVA與對硝基苯氧酰氯反應(yīng)，其硝基再用連二亞硫酸鈉還原為氨基，與酶分子中的羧基共價連接。聚丙烯醇(PAA):用分子量為250,000的PAA，經(jīng)過N-羥基琥珀酰亞胺活化后與酶的氨基反應(yīng)。聚順丁烯二酸酐:用分子量為98,000的聚順丁烯二酸酐，可以直接與酶分子的氨基發(fā)生反應(yīng)。聚氨基酸：用分子量為5,700的聚賴氨酸做修飾劑時，其氨基與酶分子上的羧基通過羰二亞胺產(chǎn)生交聯(lián)。用丙氨酸的二肽或三肽做修飾劑時，其酸酐可以與酶發(fā)生反應(yīng)。天然大分子對酶的修飾反應(yīng)肝素：肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量約為20,000，是一種含硫酸酯的黏多糖；經(jīng)過肝素修飾的酶具有良好的穩(wěn)定性，不僅可以提高酶的療效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用羰二亞胺法、三氯均嗪法和溴化氰法活化肝素，對酶分子進(jìn)行修飾。人血清蛋白：常用戊二醛法、羰二亞胺法和活性酯法對人血清蛋白進(jìn)行活化，然后對酶分子進(jìn)行修飾?；罨シò椎鞍仔揎椕甘窃诙嚯暮铣傻脑砩习l(fā)展而來的。主要過程：白蛋白琥珀化、活性酯形成和修飾酶。主要特點是反應(yīng)條件溫和，從而避免了活潑的雙功能團(tuán)交聯(lián)劑與酶接觸可能引起酶失活，減少了修飾反應(yīng)中副反應(yīng)的發(fā)生，提高了修飾酶的活性回收率。大分子聚乙二醇（PEG）修飾：利用一些可溶性大分子，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。聚乙二醇（PEG）是線性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶分子的抗原性，被廣泛用于酶的修飾。聚乙二醇末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，使酶分子被覆蓋上一層疏松的親水外殼，導(dǎo)致動力學(xué)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生許多有用的性質(zhì)，如可以在廣泛的pH范圍內(nèi)溶解等。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350大分子修飾(共價)的過程:總結(jié)修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸、聚乙二醇（PEG）等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。⑦反相膠團(tuán)微囊化⑥脂質(zhì)體包埋⑤分子間交聯(lián)④分子內(nèi)交聯(lián)③酶的大分子修飾作用②酶的小分子修飾作用①化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾④分子內(nèi)交聯(lián)：

增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過羰二亞胺活化后，然后與酶分子上的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使酶的穩(wěn)定性得到改善。⑤分子間交聯(lián)：

利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性。⑥脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問題。脂質(zhì)體是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

加H2O

疏水尾部

親水頭部

加酶液

SPEEE圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布⑦反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來發(fā)展起來的酶在有機(jī)相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性（見圖）。⑦反相膠團(tuán)微囊化⑥脂質(zhì)體包埋⑤分子間交聯(lián)④分子內(nèi)交聯(lián)③酶的大分子修飾作用②酶的小分子修飾作用①化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾（1）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代3.酶分子的化學(xué)修飾方法（2）酶分子的內(nèi)部修飾①非催化活性基團(tuán)的修飾：對非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，改變酶對特殊底物的親和力。

經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp②催化活性基團(tuán)的修飾：通過選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來實現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為化學(xué)突變法。③酶蛋白主鏈的修飾(肽鏈有限水解修飾)：主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。④肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊。③酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活-S-S-X纈天天天天賴異甘纈組57絲195靜電吸引力或氫鍵腸激酶或胰蛋白酶胰蛋白酶原-S-S-X纈天天天天異纈絲胰蛋白酶SSSS組活性中心游離的六肽胰蛋白酶原的激活過程天賴c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活（1）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代3.酶分子的化學(xué)修飾方法（3）與輔因子相關(guān)的修飾

對依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：

如果輔因子與酶是非共價結(jié)合的,可以將輔因子共價結(jié)合于酶分子上；

引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。（1）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代3.酶分子的化學(xué)修飾方法把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的專一性和穩(wěn)定性發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的鋅離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。（4）金屬酶的金屬取代：金屬離子置換修飾的過程

a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。（1）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代3.酶分子的化學(xué)修飾方法4.酶修飾后的性質(zhì)變化（１）熱穩(wěn)定性：一般來說，經(jīng)過化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修飾試劑的多個功能基團(tuán)與酶分子的多個功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性（表4-1）。（２）抗原性：修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，目前比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果較好（表4-2）。表4-1天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較酶修飾劑修飾酶天然酶處理條件(℃/時間)殘留酶活(%)酰苷脫氫酶

胰蛋白酶

過氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶Arg酶過氧化氫酶胰蛋白酶抗原性修飾劑-葡萄糖苷酶核糖核酸酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除表4-2修飾酶的抗原性變化(3)對各類失活因子的抵抗力:化學(xué)修飾酶與天然酶相比,對蛋白酶、抑制劑等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表4-3）。(4)修飾酶在體內(nèi)的半衰期：多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半衰期得到有效延長（表4-4）。(5)最適pH:大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生了變化，這在應(yīng)用上具有重要意義（表4-5）。(6)Km的變化:有些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，Km變大，這可能是由于屏蔽效應(yīng)引起的。表4-3天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾劑抗失活劑過氧化氫酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑——抗尿素抗SDS表4-4天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶過氧化氫酶修飾劑半衰期天然酶修飾酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h表4-5天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸酶吲哚-3-鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶產(chǎn)沅假絲酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.04.修飾酶的化學(xué)性質(zhì)（１）熱穩(wěn)定性（２）抗原性（３）對各類失活因子的抵抗力（４）修飾酶在體內(nèi)的半衰期（５）最適pH（６）Km的變化5.化學(xué)人工酶化學(xué)人工酶是根據(jù)酶的催化機(jī)理，模擬天然酶的生物催化功能，利用有機(jī)化學(xué)和生物學(xué)方法合成的具有專一催化功能的酶模擬物或酶；依據(jù)合成方法，又分為半合成酶和全合成酶，抗體酶就是一種特殊的全合成酶；此外，科學(xué)家還根據(jù)有關(guān)酶和輔酶的知識，用有機(jī)化學(xué)合成的方法設(shè)計、合成比輔酶分子更小簡單的輔酶模型化合物，研究其在非酶促條件下的反應(yīng)活性和催化機(jī)理。5.化學(xué)人工酶（1）半合成酶（2）全合成酶

①小分子有機(jī)物全合成酶②抗體酶③人工聚合物酶（3）輔酶模型化合物將具有催化活性的金屬或金屬有機(jī)物與具有特異性的蛋白質(zhì)相結(jié)合；

（1）半合成酶（SemisyntheticEnzyme)半合成酶：將具有一定結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)與特異的蛋白質(zhì)相結(jié)合，形成的一類新的生物催化劑。半合成酶的合成方法有兩種：

Go將具有特異性的物質(zhì)與具有催化功能的酶相結(jié)合。

GoGray與Margalit將電子傳遞催化劑[Rn釕(NH3)3]3+與巨頭鯨肌紅蛋白結(jié)合，產(chǎn)生一種半合成的無機(jī)生物酶。肌紅蛋白傳遞氧氣，[Rn(NH3)3]3+將能氧化各種有機(jī)物（如抗壞血酸）。這種人工酶的催化效率接近天然的抗壞血酸氧化酶的活力。抗壞血酸氧化酶美國Schultz小組，寡聚核苷酸鏈連接到金黃色葡萄球菌核酸酶的Cys116上（Lys116突變成Cys116

）然后，作用于單鏈RNA底物上，使底物發(fā)生了序列特異性切割這是第一個不同于DNA限制性內(nèi)切酶的RNA限制性內(nèi)切酶（2）全合成酶這類人工酶不是蛋白質(zhì)（抗體酶除外），而是一些有機(jī)化合物通過引入酶的催化基團(tuán)來控制空間構(gòu)象，象天然酶那樣能選擇性地催化化學(xué)反應(yīng)。全合成酶又分為：小分子有機(jī)化合物：是利用各種有機(jī)分子（如

-環(huán)糊精、卟啉等）和金屬離子制備的具有水解、氧化還原或轉(zhuǎn)氨等功能的全合成酶。抗體酶：具有催化活性的抗體；是利用分子印跡技術(shù)制備的人工酶。人工聚合物酶：制備原理與抗體酶相同，只是以人工聚合物代替了抗體。①小分子有機(jī)物全合成酶：是利用各種有機(jī)分子（如-環(huán)糊精、卟啉等）和金屬離子制備的具有水解、氧化還原或轉(zhuǎn)氨等功能的全合成酶。1985年Bender等人用

-環(huán)糊精的空穴作為底物結(jié)合部位，以連在環(huán)糊精上的羧基、咪唑基及環(huán)糊精自身的一個羥基共同構(gòu)成催化中心，制備了名為β-Benzyme的胰凝乳蛋白模擬酶.其中胰凝乳蛋白模擬酶催化簡單酯反應(yīng)的速率和天然酶接近，但熱穩(wěn)定性與pH