第十一章克隆與醫學

1997年2月23日，英國科學家Wilmut等宣布通過克隆技術，獲得了世界上第一只來源于體細胞的克隆羊——Dolly，“克隆”問題成為科技界、法律界、宗教界、各媒體及全社會熱烈討論的話題。克隆牛（Kato,1998）

克隆小鼠(Wakayama,1998)克隆猴“太特拉”克隆的熒光小豬(左)和正常小豬(右)

克隆貓CC(威蘇辛,2002)

克隆兔(保羅·雷納德,2002)克隆馬“普羅梅泰亞”在意大利出生。后面是它的“母親兼姐姐”。

克隆騾子(戈登·伍茲,2003）克隆狗“斯納皮”第一節克隆及治療性克隆的概念1.1．克隆的一般概念克隆(clone)：指通過無性方式由單個細胞或個體產生的、和親代非常相似的一群細胞或生物體，在不發生突變的情況下，一個克隆內的所有成員具有完全相同的遺傳構成。

克隆的概念強調：以無性的方式進行增殖或繁殖一個克隆中的每一成員其遺傳構成完全相同克隆與醫學克隆在分子水平的層次個體克隆組織器官克隆細胞克隆分子克隆克隆按照目的來分類生殖性克隆治療性克隆(1).分子克隆：利用DNA重組技術將特定基因或DNA序列插入載體或利用PCR技術獲得大量相同基因或DNA序列的過程。克隆在分子水平的層次導入擴增(2).細胞克隆:

指的是一個祖先細胞經過分裂，增殖而形成一群細胞，這些細胞具有相同的遺傳組成，該群細胞中的每一個細胞都含有相同的遺傳組成和特性，也稱無性繁殖細胞系。(3).組織器官克隆：將體細胞核移入到去核的卵細胞形成重構胚，經過一定處理，待發育到囊胚后，分離胚內細胞團，純化、培養、篩選胚胎干細胞，定向誘導分化成預定組織和器官的過程。(4).個體克隆：生物體克隆，是指用無性繁殖的方法，從體細胞得到遺傳上與原來生物體完全相同的生物體，即人工復制生物體。1958年，Steward首次證實哈布蘭特的細胞全能性設想(1).生殖性克隆(reproductivecloning)是指對生物包括人個體的復制，即從被克隆的個體獲得細胞之后，將其植入被去除了遺傳物質的卵細胞中，通過刺激使重構胚分化發育到囊胚，然后植入母體的子宮里孕育，發育為與供體完全相同的遺傳組成的個體。克隆按照目的來分類1998年9月，多莉與威爾士山羊交配，自然懷孕生下一健康小羊，取名“邦尼”。(2).治療性克隆(therapeuticcloning)是指出于治療目的而克隆人的胚胎，提取胚胎干細胞，并使干細胞定向發育，培育出健康的可以修復或替代壞死受損的細胞、組織和器官，然后移植，治療疾病。目前的外科移植手術（心、肝、腎）常見問題☆免疫排斥反應☆器官的來源問題人的治療性克隆（左）和生殖性克隆（右）生殖性克隆及治療性克隆的比較生殖性克隆治療性克隆最終產品動物或人可用于治療的細胞、組織或器官克隆目的復制動物或人修復受損的組織器官需要時間胚胎發育整個時間短，幾周移植子宮需要不需要法律限制對人禁止美、德等國反對；英、中等國支持相同點：兩者都是以細胞核移植為基礎第二節動物克隆及治療性克隆技術的基本方法2.1．動物克隆技術的基本方法動物克隆技術的理論依據是細胞具有全能性。從理論上講，動物體內幾乎所有的細胞，包括已分化的體細胞，細胞核中都含有完全相同的遺傳信息，具發育的全能性。受體卵細胞質中含有啟動細胞核重新編程的各種因子，供體核在卵細胞質內因子的作用下，可以重新回到未分化狀態。2.1動物克隆技術的基本方法動物克隆的獲得的3個途徑胚胎分割技術：人工獲得同卵雙生細胞核移植技術：1、供體細胞2、受體細胞3、核移植4、重構胚的培養及移植體細胞與去核卵細胞融合技術：不移植核，供體細胞與去核卵細胞直接融合。克隆與醫學2.1.1．胚胎分割技術克隆與醫學胚胎分割(embryosplitting)技術是指在2細胞期至囊胚期以前的早期胚胎用酶或者是機械方法分割，然后由分割的細胞分別發育產生新個體。用胚胎分割技術產生的后代數量有限，但方法較簡單，可有效地獲得同卵孿生后代。2.1.2．細胞核移植技術原理：利用細胞拆合或細胞重組技術，將卵母細胞去核作為核受體，以不同來源細胞核作為核供體，將后者移入前者中，構建重組胚，供體核在去核卵母細胞的胞質中重新編程，啟動卵裂，開始胚胎發育過程。動物克隆技術的核心是核移植。克隆與醫學克隆與醫學細胞核移植技術的技術路線(1)供體細胞的準備(2)受體細胞的準備(3)核移植(4)重構胚的培養及移植(1)供體細胞的準備

用于細胞核移植的供體(donor)細胞有：早期胚胎細胞、胚胎干細胞和體細胞，它們可來自活體或體外培養的細胞。供體核處在GO/G1期：容易獲得最佳克隆效果。這時的細胞雖然代謝比較活躍，但細胞卻置身于細胞分裂周期之外；供體核處在Ｓ/G２期：受體卵母細胞質指導的潛在的基因組復制將導致異常的發育。胚胎細胞核移植體細胞核移植

(2)受體細胞的準備

核移植的受體(recipient)細胞有：去核卵細胞、受精卵和2細胞胚胎，其中多以卵細胞作為受體。卵細胞一般采用超排卵法或卵巢的卵泡，經體外培養成熟而獲得。將收集到的受體細胞經顯微操作或其他方式去除細胞核。

供體細胞與受體細胞的細胞周期同步化。卵母細胞的去核：(3)核移植利用顯微操作技術，將供體核移入去核受體細胞質形成重構胚。卵子的激活：在正常受精過程中，精子穿過透明帶及卵黃膜時，引起卵子內鈣離子濃度升高，卵子細胞周期恢復，啟動胚胎發育，這一現象稱為激活。胚胎克隆時，通常用一定強度的電脈沖作用卵母細胞。(4)重構胚的培養及移植完成核移植后形成的單個細胞在體外培養一段時間，或者是移入離體輸卵管（同種或異種）進行體外培養，待獲得發育的重構胚（囊胚或桑椹胚）后再移入雌性子宮或輸卵管進行發育，直到出生。通過核移植得到的胚胎可作供體，再進行細胞核移植，稱再克隆。2.1.3．體細胞與去核卵細胞融合技術供體細胞不一定是核，可以是含部分細胞質甚至是整個細胞不進行核移植，而是用細胞融合技術，使供核細胞與去核卵細胞融合獲得重構胚融合方法有：電融合、化學融合、病毒融合等。2.2．治療性克隆技術克隆與醫學治療性克隆技術是克隆技術、胚胎干細胞技術、移植技術結合的一種綜合技術。Somaticcellnucleartransfer

directdifferentiationReplacetherapyEstablishofEScells2.2．治療性克隆技術取患者體細胞，體外培養，使細胞同步化顯微注射移入去核卵母細胞構建重構胚體外培養至囊胚分離細胞團，獲得胚胎干細胞對胚胎干細胞進行基因修飾，定向誘導分化移植入患者病變部位，替代病損細胞、組織器官，達到治療的效果人的治療性克隆（左）和生殖性克隆（右）第三節動物克隆技術的應用前景3.1．動物克隆技術與醫學克隆與醫學(1)克隆技術與醫藥生產

結合轉基因技術制備動物生物反應器(2)克隆技術結合轉基因技術構建疾病動物模型(3)克隆技術與組織工程(4)動物克隆技術與與基因療法結合治療遺傳疾病(1)克隆技術與醫藥生產克隆與醫學★將轉基因技術與克隆技術有機結合，以動物體細胞為受體，將藥用蛋白基因以DNA轉染的方式導入能進行傳代培養的動物體細胞內，再以這些攜帶目的基因的體細胞為核供體，進行動物克隆。★應用克隆技術還可構建疾病動物模型，以研究疾病的發病機制、治療方案和防治措施。也可應用體細胞克隆技術和干細胞技術研究疾病基因組、功能基因組、以及基因的功能。(2)克隆技術與組織工程克隆與醫學★組織工程(tissueengineering)是近年來發展起來的一門新興交叉學科，它是應用工程學和生命科學的原理和方法，創建組織和器官或替代物，植入體內，修復組織缺損，替代損傷的組織、器官，達到提高生活、生存質量，延長生命的目的。★利用治療性克隆技術獲得組織工程所需的胚胎干細胞可用于培育各種組織、器官進行移植；也可接種于由生物可吸收材料構成的三維結構中，經過適當培養，形成具有一定組織結構的移植物，移植于受損傷部位，細胞繼續分裂、分化、重組成新組織，避免排斥反應。人耳鼠”是先使用可降解材料經過耳形壓模，聚乳酸（PLA）溶液浸泡使其強度增強，制成耳廓支架材料，然后讓細胞在支架上繁殖生長。經過1-2周體外培養，在裸鼠背上割開一個口子，植入“人耳”。隨后，“人耳”的支架會自己降解消失，“長”在老鼠的背上。(3)與基因療法結合治療遺傳疾病克隆與醫學克隆技術與基因療法結合使用，能全面、徹底、高效地治療遺傳性疾病。但這只是理想的愿望，要克服技術上、倫理上的諸多困難，在目前情況下是不行的。3.2動物克隆技術與遺傳育種克隆技術是一種無性繁殖技術，也稱為生物復制技術，體細胞克隆技術的發明和發展極大地擴大了核供體的來源，利用其優勢，復制實驗動物成為一個主要用途。

★擴大優良種群：提高育種效率；加快育種進展

★保存基因資源

★拯救瀕危動物★滿足生物醫學實驗對實驗動物的特殊要求

3.3．克隆技術存在的