皮膚影像的研究進展

1皮膚影像學的發展皮膚組織病理學是皮膚科學不可或缺的組成部分。它不僅是許多皮膚科疾病的診斷標準，也是皮膚科疾病發生和發展規律的基礎，是皮膚科疾病的治療。皮膚組織病理學經過200余年的發展,已經普及并延伸出免疫病理等多個分支。然而,組織病理學活檢取材一般為創傷性的,患者疼痛、易感染、留疤痕,病理切片的制作費時費力,且僅能提供活檢部位的信息,監測疾病變化、評價療效、確定皮損的邊界等常需要反復活檢,這一切都降低了患者的依從性。皮膚科臨床的發展需要無創性、原位、實時、動態的檢測方法,對可疑皮損進行重復檢查,提供客觀量化的評價指標。臨床的需求促進了皮膚影像學的產生和發展。皮膚影像學是利用現代超聲、光學、磁共振等手段對皮膚病進行無創、原位、動態、實時診斷的一門新型技術學科。過去十幾年作為醫學影像學分支的皮膚影像學取得了長足的進步,包括皮膚鏡、皮膚共聚焦技術、多光子成像、光學相干層析成像和光聲成像等多種光學成像技術用于臨床疾病診斷已成為可能。本文將對皮膚影像學的幾種主要成像技術,結合原理及具體臨床應用做簡要的介紹。2皮膚鏡2.1皮膚鏡的應用皮膚鏡,又稱為表皮透光顯微鏡、皮表顯微鏡、入射光顯微鏡等,是一種在體觀察皮膚表面以下微細結構的、主要針對色素性皮膚疾病的無創性輔助診斷儀器。它通過使用油浸、光照與光學放大設備,可以觀察到包括表皮下部、表真皮連接以及乳頭層真皮等肉眼不可見的皮膚結構,從而確定需要做活組織檢查的皮損部位,保證切除的準確性,其對于惡性黑色素瘤早期診斷的重要輔助價值已為大量研究所證實[1~6]。作為臨床上諸多疾病的篩選和診斷工具,皮膚鏡具有無損傷、診斷迅速、價格低廉等優點,有著良好的發展前景。利用顯微鏡來觀察皮膚表面可以追溯到1663年,JohanKolhaus在顯微鏡下觀察到指甲甲襞下的微小血管。19世紀末,德國皮膚病學家Unna把油浸法應用于皮膚的顯微檢查,以減少皮膚表面的直接反射光,使觀察更加清楚。20世紀初,Saphier將雙筒顯微鏡和內置光源相結合,對皮膚解剖結構進行了形態學觀察。20世紀50年代,美國的Goldman首次提出dermoscopy一詞,并將其應用于色素皮損的診斷。1971年,英國的RonaMackie研究表明,皮膚鏡在提高色素皮損的術前診斷以及鑒別良性色素痣和惡性黑色素瘤上有很大意義。其后,關于皮膚鏡的研究在奧地利、德國、美國以及世界各地得到延續。第一屆皮膚鏡的共識會議于1989年在德國漢堡召開,2001年,第一屆世界皮膚鏡大會在羅馬舉行。現在,皮膚鏡在歐洲已成為一項常規技術,并在世界其他地區獲得越來越多的認可。2.2雙側左面質的皮膚鏡由于皮膚的光密度和折射率與空氣不同,照射到皮膚表面的光線很大部分被角質層直接反射,另有部分為皮膚吸收,僅有少量通過散射進入皮膚,因此很難用肉眼直接看到皮膚表面下的結構。傳統皮膚鏡采用的是浸潤法:首先在皮膚表面滴加油脂等浸潤液以增加皮膚角質層的透光性和減少反射光,然后用玻片壓平并給予適當角度的光線照射,借助于特定的光學放大設備,可以觀察到表真皮連接處、真皮的結構。使用的浸潤液可以是水、礦物油、乙醇和凝膠等。最新的研究表明,體積分數為70%的乙醇具有較少的氣泡,可產生清晰圖像,并且具有不油膩、不染色、自然揮發無需擦拭、可有效減少細菌污染的特點。水溶性的凝膠(例如超聲用耦合劑)不會流動或者產生灼燒,因而在眼睛或者粘膜區域(例如嘴唇)應用較多。簡單的手持式皮膚鏡(圖1)由鹵素燈或發光二極管(LED)光源、標準放大物鏡(通常為10倍)以及玻片組成,價格低廉且便于使用。有些可通過特定的轉接環與數碼相機連接,便于將成像結果及時拍照存檔,為以后的診斷和治療服務。昂貴的雙目皮膚鏡包括6~40倍的放大范圍,可以提供高質量的成像,并對皮膚進行三維觀察。電子皮膚鏡中整合有視頻攝像頭,通過數據線將視頻數據傳輸到電腦中,在顯示器上觀察的同時,可對圖像進行處理,利于疾病的準確診斷,也可將數據存入數據庫,便于歸檔調用。傳統的浸潤型皮膚鏡由于需要采用耦合劑即浸潤液,可能會引發接觸性皮炎和醫源性交叉感染。近年來,一種新出現的偏振光皮膚鏡克服了浸潤型皮膚鏡的缺點。偏振光皮膚鏡是21世紀開始發展起來的皮膚鏡技術,主要利用交叉偏振的原理,不需涂抹浸潤液,就可消除皮膚表面反射光的影響。入射光通過一個線偏振片照射到皮膚表面,直接反射的光保持原來的偏振方向,而被皮下組織散射的光改變了偏振方向。使用與第一個偏振片偏振方向垂直的線偏振片即可把直接反射光濾去(圖2),從而可以觀察到皮膚下的組織結構,這樣就提高了皮損的可視性。觀察時鏡片不直接接觸皮膚和無需耦合劑,減少了人為對皮膚的擠壓,即可觀察到清晰的原始圖像,特別適合頭面部,尤其在口、眼和鼻等粘膜處以及敏感性皮膚的圖像觀察,可避免由浸潤法觀察時鏡片直接接觸皮膚的擠壓變形和所需的浸潤液作耦合劑而引起交叉感染等潛在危險。2.3皮膚鏡的診斷較之傳統的毛細血管鏡,皮膚鏡可以直接觀察皮損部位的深在微細結構,為皮膚形態學開辟了一個新的研究領域。在減少不必要的活檢、方便疾病隨訪與大規模普查、圖像資料的保存與提取方面有著明顯的優點。皮膚鏡在臨床上可以用于多種皮膚病的在體檢查,其中基本的皮膚鏡圖像包括色素網、小點、小球、分支條紋、偽足、放射流、條紋、無結構區、大斑點、退化結構、藍白幕和血管結構等(圖3)。醫生可以借助皮膚鏡觀察到不同皮膚病的不同表現從而為臨床診治提供可靠的依據。皮膚鏡已經成功地應用于惡性黑素瘤的臨床診斷。對于以惡性黑素瘤為核心的色素病的皮膚鏡鑒別診斷,目前多推薦用兩步法。第一步先區分黑素性皮損與非黑素性色素性皮損:診斷為黑素性皮損,至少應具備色素網、色素紋、群集性小球、均質藍色色沉等指征之一;如沒有,則診斷為非黑素性色素病,并進一步尋找非黑素性皮損的特點。第二步為區分良性與惡性的黑素性損害:有多種方法,最經典的是1987年由Pehamberger等建立的模式分析法。此法要求對多個皮膚鏡指征逐一進行詳細評估、比對,然后得出最終診斷。此法雖然具有較高的敏感性、特異性和診斷準確率,但要求診斷者接受過相關的正規培訓,否則會影響診斷準確率。為提高可操作性和可重復性,許多研究小組根據各自經驗創立了不同的診斷方法及標準。常用的有Stolz等的皮膚鏡ABCD法則,Menzies等的診斷侵襲性惡性黑素瘤的11點特征法,Aegenziano等的7點核對表,DalPozzo等的7點特征法等。近年來的研究分析也證實,對于有經驗的檢測者,皮膚鏡可顯著地提高惡性黑素瘤的診斷準確率。此外,應用皮膚鏡技術還可明顯提高Spitz痣、基底細胞癌、血管瘤的診斷準確率,并可以用于脂溢性角化病、銀屑病、日光性黑子、色素性光線性角化和皮膚纖維癌等多種皮膚疾病。3皮膚超聲檢查的特點皮膚科臨床的發展需要無創性、原位、實時、動態的檢測方法,對可疑皮損進行重復檢查,提供客觀量化的評價指標。然而,皮膚鏡只能對皮損表面進行檢查,對于深層皮膚結構無能為力;皮膚超聲雖然能對深層皮膚結構進行檢測,但其圖像分辨率較低,不能達到細胞水平,無法根據其聲像圖來判斷皮膚腫瘤的良惡性和確定皮損的浸潤范圍,其檢查結果也易受患者體位、探頭壓力等多種因素影響。基于共聚焦原理的皮膚原位、在體、實時、動態三維成像技術[皮膚計算機斷層掃描技術(CT)]克服了以上幾種方法的局限性,是具有廣闊發展前景的無創性皮膚影像學方法。3.1從clsm發展到產物1957年,Marvin在他的專利中闡明了共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)技術的基本原理;1985年,Wijnaendts等成功地用共聚焦激光顯微鏡演示了用熒光探針標記的生物材料的光學橫斷面,標志著共聚焦激光顯微鏡的關鍵技術已基本成熟。而第一臺商業化的共焦掃描顯微鏡則是到1987年才問世。之后的十幾年間CLSM發展非常迅速。CLSM是一種先進的細胞生物學分析儀器,是一項具有劃時代意義的高科技新產品,是近代生物醫學圖像分析儀器最重要的發展之一,有細胞“CT”之稱。它是隨著激光、視頻、計算機等技術的飛速發展而誕生的新一代顯微鏡,在研究和分析活細胞結構、分子、離子的實時動態變化過程,組織和細胞的光學連續切片和三維結構重建等方面,是傳統光學顯微鏡所望塵莫及的。20世紀90年代中期,學者們將CLSM進行改造,使其能夠實現對活體皮膚的無創、實時成像,由此奠定了皮膚CT在皮膚科推廣應用的基礎。3.2皮膚ct成像技術原理傳統光學顯微鏡的基本結構主要由機械部分、照明部分和光學部分(反光鏡、聚光鏡、光圈、目鏡和物鏡等)組成。皮膚CT的基本結構除了光學顯微鏡部分之外,主要由激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統(包括數據采集、處理、轉換及應用軟件)、圖像輸出設備和共聚焦系統(圖4)等部分組成。由此可見,皮膚CT具有傳統光學顯微鏡所不具備的復雜計算機系統、激光系統、掃描裝置和共聚焦系統;另外一個最主要的區別在于光源的不同。光學顯微鏡的光源一般是自然光或者是內置燈源,可見光經反光鏡、聚光鏡的作用,對全視野進行照明,它只能對標本局部厚度作平面成像。這樣不僅要求標本為薄切片(5~10μm),而且標本上任何一點的圖像都會受到鄰近點衍射光和散色光的影響,降低了圖像的反差和分辨率。而皮膚CT采用點光源代替傳統光鏡的場光源,光源、探測器及被測樣品置于共軛位置。聚焦層面的光點通過一系列透鏡最終可同時聚焦于光源針孔和檢測針孔,也就是所謂的“共聚焦”。從光源出射的光經物鏡準確地照明物鏡焦平面的被測樣品,由樣品反射的光信息被聚焦到針孔處,形成點像,從而通過針孔被探測器接收。而非焦平面反射的光信息,則在探測面上僅僅形成彌散斑,此時通過針孔被探測器接收到的光信息很少。也就是說,探測到的離焦信號強度遠低于焦點信號強度,對離焦信號的擯棄使共焦成像術可在三維空間上精確定位被測樣品。以激光作光源并對樣品進行掃描,在此過程中兩次聚焦,因此稱為共聚焦激光掃描顯微鏡。其產生的光信號由檢測針孔后的光電倍增管逐點接收后,轉變為電信號傳輸至計算機,在屏幕上呈現為清晰的整幅焦平面圖像。點光源可通過對樣品進行左右、上下掃描來獲得厚標本(可達500μm)不同層面的圖像,亦即可對細胞或組織厚片進行類似CT斷層掃描的無損傷性連續光學切片,連續光學切片經計算機三維重建處理,能夠從任意角度觀察標本的三維剖面或整體結構。因此該技術被稱為皮膚CT。皮膚CT圖像基于細胞器和組織機構自身的折射率不同而得以實現高分辨率;皮膚組織中黑色素和角蛋白具有較高的折射率,是自然對照物。高折射率結構對比明亮,低折射率結構則顯灰暗。3.3皮膚ct的應用皮膚CT能夠在細胞水平上實時、動態觀察皮膚組織的形態結構,皮膚CT在皮膚科主要應用于:1)檢測/監測藥物經皮輸送過程;2)檢測細胞器超微結構和皮膚組織細胞因子變化;3)檢測/監測傷口愈合的過程;4)皮膚科疾病的診斷、鑒別診斷、療效評價和隨訪。皮膚CT在毛囊炎、銀屑病和血管性皮膚病等皮膚病的診斷中極具應用價值。皮膚CT應用于皮膚腫瘤或癌前性皮損的診斷、預后評價和確定腫瘤皮損與周圍正常皮膚邊界。自1995年首次報道皮膚CT在體觀察皮膚以來,目前皮膚CT已經用于多種皮膚疾病的臨床評估,并顯示良好的臨床應用前景。腫瘤的診斷和癌前病灶的評價仍是大家最感興趣的研究領域。Gerger等從20例黑素瘤和50例色素痣的3709幅混合成像中篩選出兩種疾病的皮膚CT形態學特征(圖5),隨后用三步法模式來診斷色素痣和黑素瘤,結果發現兩者診斷正確率分別為92.4%和97.6%,顯著優于目前廣泛應用于臨床的皮膚鏡。Gerger等先前也進行過類似的臨床實驗,評估報告顯示,皮膚CT對黑素瘤、色素痣、基底細胞癌以及脂溢性角化的診斷準確率分別為96.30%,98.89%,100%和100%,顯示很好的臨床可靠性。目前美國Lucid公司生產的Vivascope1500系統(圖6),其采用的光源為830nm近紅外光,橫向分辨率為1~2μm,縱向分辨率為3~4μm,穿透深度可達200~500μm,能在細胞水平在體觀察表皮和真皮淺層,滿足大多數皮膚疾病的影像學診斷。4用于皮膚科診斷的多光學圖像4.1多光子層析成像幾十年來,皮膚診斷學一直建立在二維層次上,通常在白光或者使用伍德氏燈照明的條件下用裸眼或通過放大鏡觀察。伍德氏燈是一種紫外/藍光光源,可以提供表面熒光的信息。為了獲得數字化的皮膚影像,電荷耦合器件(CCD)鏡頭和圖像處理軟件開始投入應用。具有代表性的是作為光源而投入使用的偏振發光二極管,然后用CCD鏡頭獲取散射光。當使用紅光或者紅外光時,相對于藍光和紫外光,漫反射信號可以得到皮膚的深度信息。表皮和真皮的三維成像可以用超聲波或者光學相干層析(OCT)系統獲得。然而,這些技術卻不能對單一的內組織細胞或者胞外基質結構成像觀察。要想對細胞和亞細胞層次結構進行觀察,并且能夠提供合適的分辨率,就需要采用共焦掃描熒光,但是這類系統存在著一個主要的缺陷,就是它需要引入外界的異硫氰酸熒光素(FITC)熒光標記。與上述情況形成對比的是,多光子層析成像作為一種能夠達到亞細胞級別精度的新式多層面成像技術,能夠敏感地檢測內在熒光基團發光以及膠原細胞外基質的二次諧波(SHG)信號,并且不需要對皮膚進行染色。從原理上來說,單分子檢測可由單光子計數(SPC)技術實現。這是因為它的基礎并不是建立在共焦檢測上,所以不需要針孔,信號并不需要向后傳輸通過掃描系統。多光子層析成像能夠實現對深層組織細胞和細胞室的成像。尤其值得一提的是,熒光線粒體中輔酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD(P)H]的減少也可以被檢測到。而這種輔酶的氧化物NAD(P)并不產生可見區內的發射。這樣利用NAD(P)H圖譜就能夠得到細胞內氧化還原狀態和新陳代謝變化的信息。多光子層析成像能夠精準地實現皮膚深層成像,甚至能對單個細胞內的線粒體成像。這樣就可以通過對自發熒光的分析檢測并區分細胞角質化、基底干細胞、黑色素細胞和巨噬細胞以及內網的彈性纖維和膠原束。也可以對藥物和化妝品成分在皮膚下的擴散進行跟蹤監測。這樣無痛無創亞細胞層次分辨率的三維光學皮膚活檢即得以實現。4.2x/y-檢流計及熒光/shg成像技術要實現雙光子吸收過程,需要高強度近紅外光。在激發熒光的過程中,雙近紅外光子同時吸收,兩個光子共同提供激發所需要的能量。該能量總和等于熒光基團在基態S0和激發后達到的電子能級S1之間的能量差。對于三光子吸收過程,同時吸收的是三個光子。高數值孔徑聚焦光路把低平均功率的激光在一個微小的焦點體積內聚焦到所需要的高強度(圖7)。吸收和熒光/SHG激發都只發生在這個不到飛升的體積內。這樣當使用脈沖頻率高達兆赫茲到吉赫茲的飛秒激光器時,平均功率只有幾毫瓦。從而在使用遠紅外激光器時可以避免以往由較低的單光子內部組織吸收系數導致的熱損傷、光漂白和失焦熒光/SHG激發。利用x,y方向上的檢流計掃描器和一組壓電驅動聚焦光路,可以在三維空間內以亞微米步進的精度改變雙光子激發體積的位置。這就使無創深層組織光學切片能夠達到亞細胞的精度。通過在反掃描模式(熒光/SHG不通過光學掃描器)下采用無針孔檢測器,就可以實現具有較高光子采集效率和單光子靈敏度的三維成像。針對這一點,圖像處理必須結合像素時鐘函數和x/y-檢流計,z-壓電系統的幀同步信號。在雙光子層析成像中的標準激光光源應當是鎖模的鈦藍寶石激光器,工作可調波長范圍在700~1000nm之間。這樣可以檢測到350~500nm的SHG信號和350~700nm的熒光信號。典型的熒光發光壽命一般在納秒級范圍內。當使用皮秒級上升時間的快速光子檢測器和時間相關的單光子計數技術時,在時域內的熒光衰減動力學模型可達到較高的亞細胞空間精度。對衰減曲線進行圖像處理可以得到每像素的平均熒光功率,對此進行計算則會得到熒光壽命(FLIM)圖像。表1列出了臨床多光子層析中可檢測到的主要內源皮膚熒光基團和SHG活躍分子。最吸引人的熒光基團是藍/綠發光輔酶NAD(P)H,這是一種通常情況下需要紫外光激發的基團。由于紫外光的穿透深度淺,單光子技術不能實現對深層組織區域內的該輔酶成像。然而,近紅外激光脈沖作用下的雙光子激發卻可以實現對基底細胞層甚至皮內細胞層細胞內線粒體中的鈣該輔酶成像。有趣的是,用近紅外飛秒激光脈沖激發黑色素時,發光最強的區域位于光譜中的黃/紅區域。卟啉類化合物,如糞卟啉和原卟啉,它們的熒光發光壽命長,從而可以在某些皮膚細菌(如丙酸菌座瘡)中或是采用了5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)處理過的線粒體中成像。熒光壽命是分子和其所處環境的一個特征參數。比方說,壽命分別為5.2,10~12和2~3ns的熒光分別對應著自由黃素單核苷酸、原卟啉XI單體和二聚體。再比方說,自由NAD(P)H的熒光壽命只有0.3ns左右,而NADH的蛋白復合物的熒光壽命的標準值卻可以達到2ns。4.3皮膚和表皮的熒光內部組織熒光基團角蛋白主要存在于六角形的角化細胞中,這類角化細胞主要存在于外層角質層(SC),平均直徑為(36±15)μm,而黑色素主要存在于頭發和基底細胞層中。角蛋白和黑色素能產生最強烈的熒光信號。實際上,當平均功率為2mW(25pJ脈沖能量)或者略小的激光就足可以在快速掃描模式下對SC和毛發內部組織進行光學切片(快速掃描模式的標準狀態為1frame/s,每幀512pixel×512pixel)。當需要為內部組織光學切片進行基于雙光子NAD(P)H熒光的高分辨率成像時,掃描速度要達到8frame/s,這是由平均光束駐留時間30ms/pixel決定的。對于深入成像,當成像的組織深度為100μm(750nm波長)時,入射激光功率通常為20~30mW。高分辨率成像可從整個表皮甚至真皮結構中獲得。每個表皮細胞形態和細胞內部結構都可以清楚地呈現。無熒光的細胞核的精確位置和細胞分裂都可以成像,在系統的光學變焦下甚至可以看見單個組織內的熒光線粒體(圖8)。真皮的光學切片使對單條彈性蛋白纖維、膠原質結構和毛細血管的觀測成為可能。通常情況下,參照聚焦光路的工作距離,監測深度一般為200μm。外層角質層的角質化死細胞一般無核,扁平呈鱗狀,能有效阻擋外部化學物質、微生物,并防止體內水分流失。這一層“壁壘”可以轉化為10μm厚的顆粒層(SG)的顆粒,第一批活的角質細胞死亡時,這種轉化就可被檢測到了。在棘層(SS)中,利用細胞質中的強熒光顆粒和無熒光的圓而大的核邊界,可以清楚地觀察到單一的角質化細胞和它們的細胞室。細胞直徑隨著在組織中位置的深入從(26±3)μm減少到(16±4)μm。對表皮細胞層的最底層,也就是基底層(SB)的檢測是利用對基底角質干細胞[直徑為(9±1)μm]的強熒光的監測實現的。這些細胞通常都會在一個月的時間遷移到皮膚表面,并在這個過程中逐漸分化。而在牛皮癬的病例中,細胞分裂和遷移到皮膚表層的兩個過程分別只用了36h和4天的時間,角質化細胞中的90%都是表皮細胞。真皮和表皮之間轉化的深度通常是變化的,由乳頭狀突起決定。女性實驗對象的轉化深度通常在55~70μm,而男性則為70~100μm。結締組織,特別在厚度小于1μm的單條長熒光彈性纖維可以由自發熒光清楚地呈現。膠原蛋白結構的自發熒光通常較弱,然而,雖然檢測方向是反向的,但SHG信號更強。SHG最初是和光束方向同向,但是在多次散射后就不再遵循原方向。現已發現的膠原類型有28種。在皮膚中,存在著第一類膠原和它的三螺旋體。通常情況下,從時間分辨的單光子計數測量中可以得到每個體元的雙指數曲線(振幅A1,A2,熒光壽命τ1,τ2,平均熒光壽命t)。短曲線的標準時間在檢測器的響應時間以內,很可能是SHG信號,少量的散射光和一些快速衰退的熒光基團,比如說黑色素。長一些的曲線源自自發熒光,通常對于內組織細胞在1.8~2.4ns的量級上。因為偽彩色編碼和亮度有關,所以在空間分辨的FLIM中可以獲得四維信息(圖9)。FLIM已經用于研究黑色素的不同類別和染發物質在頭發中的積累過程。單光子技術也被用于獲取皮膚年齡。在這種應用里,膠原的彈性系數可由雙光子彈性蛋白的自發熒光和SHG測定。實際上,帶通濾波不同的雙SPC檢測器結合到分束器的前方,分束器可將短波SHG信號和熒光長波信號分離,而SPC檢測器和分束器結合后,可以在800nm左右的激發光狀態下同時工作。真皮二次諧波-熒光老化指數(SAAID),或者稱作比率,反應了皮膚的年齡。測量體內SAAID可以揭示40歲以上婦女比同齡男性更快衰老的機理以及吸煙對人體的影響。5圖像中的石頭5.1點頭成像技術phOCT技術是第一種以相干為特性的醫學成像技術,其理論基礎是早期的白光干涉測量法,起源于最初用作網絡故障檢測的光學相干域反射測量技術(OCDR)。OCDR原本用于檢測光纜的瑕疵,但不久人們就認識到它具有探測眼睛和其他生物組織的能力。OCT概念的首次提出是在1991年,美國麻省理工大學的Huang等采用OCT技術成功地對人眼視網膜的細微結構和動脈壁成像。1993年,演示了人類視網膜的活體光學相干層析成像。1995年,開始眼科的臨床研究。短短10年間,OCT迅速發展起來,在分辨率和性能上有了很大的提高,并由此拓展出多種成像模式,如多普勒OCT(ODT),偏振敏感型OCT(PS-OCT),光譜OCT,差分吸收型OCT和與雙光子熒光或超聲結合的OCT技術,并在同內窺鏡結合的方式中實現了對內部器官的斷層成像。這些不同模式的成像為從微觀上更好地觀察組織結構,了解其生理功能提供了手段。5.2典型的系統結構如圖10所示,OCT總體系統主要由低相干光源、干涉儀、光學掃描機構組成。5.2.1增設ph的源泉在首次對人眼視網膜成像的示范中,使用了850nm的超發光二極管(SLD),它對眼球的玻璃體和視網膜都有很好的穿透能力。而對于其他人體組織,由于高散射特性加強了光的衰減,因此還需要新的光源來提高穿透力。評價適于OCT成像的光源有4個主要指標:波長、帶寬、單傳播模式和穩定性。其次從光源的應用角度考慮,應著重于使用方便,易于攜帶,兼容性好。因為短波長的光(如藍光),它的光子在組織中的平均散射路徑短,不能滿足OCT的軸向探測深度,所以OCT光源一般采用近紅外光。另一方面,水分子對2μm左右波長的光有較強吸收,因此OCT的工作波段在1.2~1.8μm之間為最佳。5.2.2模擬的間濾波器、反射鏡的應用和完善的光纖式多通道光耦合技術OCT系統的核心在它的干涉儀部分。典型的干涉結構是基于光纖的Michelson干涉儀,如圖11所示,在這種結構中,光源發出的光通過單模光纖傳輸,在耦合器處被分為兩束光,其中一束由另一根單模光纖傳至參考鏡。而原光纖傳輸的那束則進入樣品臂。樣品臂的光纖末梢有兩個作用:其一作為相干光的收發器,其二可作為類似于共焦針孔的空間濾波器。但是這種結構的一個缺點就是從參考臂返回的直流信號和強度噪聲都加載到干涉信號上了。圖11(b)和(c)中的對稱結構利用兩個光電探測器所得的光電流相減方法來消除背景噪聲,增強了干涉信號。圖11(c)的馬赫-曾德爾結構可用于反射模式也可用于傳輸模式。在OCT系統中使用光纖有很多方便的地方,但不是必需的。實際上在許多應用場合中,分離式干涉儀有其獨特的優點。各式棱鏡和反射鏡的應用給干涉儀的設計增加了靈活性,尤其在樣品臂和參考臂的光耦合問題上。因為許多單模光纖都是由硅這種雙折射材料做成的,光纖彎曲會引起光束偏振態的改變,因此在光纖式OCT系統中經常要加上調整光偏振態的調制器。空間分離式干涉儀結構則可避免這些問題。圖11(d)~(f)列出了幾種可能用于OCT系統的分離式干涉儀結構。圖11(a)的結構等價于邁克耳孫干涉儀,用分束器替代了2×2光纖耦合器。圖11(e)的結構可以將半導體光源和探測器結合用于手握式掃描儀使結構更緊湊。此種結構的干涉儀可容易地解決偏振態問題和參考臂與樣品臂之間的散射不匹配問題。圖11(f)等效于馬赫-曾德爾光纖結構。5.2.3維/三維層析圖像軸向的掃描方式從OCT成像原理分析,為測量出樣品軸向深度方向的各點信息,與它做干涉的參考臂就需要改變其長度以匹配樣品臂的光程,通過得到干涉的等光程點獲得樣品信息。即OCT系統所構成的二維/三維層析圖像軸向深度的測量是通過掃描參考臂得到的,因此OCT的圖像質量與參考臂的掃描有直接關系。掃描方式是利用各種光學延時線改變兩臂的光程差。對于參考臂的掃描,首先要求路徑必須是在一個有限范圍內變化以覆蓋成像所需的軸向長度,對于眼睛成像路徑要大于2cm,對于皮膚和其他高散射組織則為2mm;其次,掃描定位精度必須小于光源的相干長度。5.3皮膚組織結構、組織形態、優點OCT圖像顯示的是皮膚結構的縱斷面,與皮膚CT的皮膚橫斷面成像不同,而與皮膚組織病理相同,符合傳統的觀察習慣。由于皮膚紋理的存在,皮膚表面呈現波浪形,皮膚對光的反射導致其表面呈現明亮的強信號帶,在這個信號帶下面,可見分層結構。角質層皮膚最為表淺,表現為低散射帶,境界清楚,僅在掌跖皮膚處明顯可見,較厚,如指尖皮膚角質層平均厚度約300μm,而其下方表皮厚度僅為100μm。角質層內部還可見一些螺旋形汗腺導管,表現為高度散射(圖12)。角質層和其下方表皮組織界限分明,如箭頭所示為顆粒層,而真表皮交界常模糊不清。在掌跖以外的其他部位皮膚,角質層下方的表皮是OCT圖像第一層(圖13),表皮信號弱于真皮層,如果真表皮交界平坦,易于與上層真皮區分開來。真皮常表現為信號較強,而其內的管腔如血管等的信號弱(圖13),呈現無信號圓形或長形結構。真皮內還存在一些低散射區,代表毛囊和皮脂腺(圖14)。此外,較薄的真皮下部也可見低反射的皮下結構,皮膚表面毛發可引起信號陰影。除了表皮或真皮結構,OCT還可用于人類指甲的成像,較高分辨率的OCT證實了雙層狀結構的存在。實際應用中注意到OCT成像受皮膚不同生理狀況的影響,角質層厚度不影響其深層組織的光學特性,而黑素可輕微減少真皮中的信號強度,紅斑和水腫可減少光衰減。OCT可對正常皮膚的厚度進行測量。簡單的測量方法是通過普通A掃描和B掃描進行。在普通A掃描中第二個峰代表真表皮交界,而第2個反射層是由于光在真皮膠原纖維中的后向散射所致,通過測量峰與峰之間的距離可估計表皮的厚度。B掃描也可測量表皮的厚度,通過測量工具測量從皮膚表面反射即入射信號到第一個界清反射面的距離而獲得。為增加OCT成像在皮膚中的穿透深度和改善OCT成像的對比度,甘油、丙二醇等高滲性物質作為透光劑已應用于OCT成像領域(圖15),透光劑可影響皮膚的光散射性質,導致光衰減的降低,使真皮變得透明,從而增加了OCT光信號的檢測深度。透光劑引起的皮膚組織的透明效應是由于這些物質的高滲透性引起水從細胞內向細胞外移動,導致了膠原和基質的折射指數改變。但甘油對角質層的作用是不同的,該物質是自然保濕因子,增加角質層結合水的能力,降低角質層的不透明性。傳統的OCT橫向分辨率為10~15μm,常能鑒別掌跖角質層、表皮和上層真皮及皮膚附屬器和血管。理論上超高圖像分辨率約1μm的技術才可能研究細胞水平的變化,但超高分辨率成像在高度混濁的介質如皮膚中仍是一個技術問題,高輸出寬帶光源如飛秒激光在不遠的將來可能解決這個問題。除了高分辨形態學研究,常規OCT應用局部物理學參數可研究組織特征,在美容和藥物工業中得到青睞,基于光譜分析、組織雙折射和多普勒血流的功能性OCT成像在皮膚科領域也已取得顯著的進展。總之,OCT不能完全取代活檢組織學或其他診斷手段,但從對疾病非損傷診斷及監測治療效應角度,OCT能發揮重要的輔助作用。6光色調成像6.1生物組織無損檢測技術對生物組織進行成像,是研究生物組織的結構特征、功能及醫學臨床診斷的重要手段。光聲層析成像(PAT)是近年來迅速發展的一種新的無損醫學成像方法,該技術結合了組