第五章目的基因的獲取目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因。一、限制性內切酶法用限制性內切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切由于帶有粘性末端，產物可以直接與載體連接。1.優點2.缺點目的基因內部也可能有該內切酶的切點。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene1.限制性內切酶局部消化法控制內切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內切酶識別位點的堿基數影響所切出的產物的長度和隨機程度。（1）限制性內切酶的選用原則1）4bp的內切酶平均每46（4096）bp一個切點。2）6bp的內切酶平均每44（256）bp一個切點。隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。（Sau3A—BamHI）（1）超聲波超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。（2）高速攪拌1500轉/分下攪拌30min，可產生約8kb的隨機片斷。1976年H.G.Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于1979年在science上發表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸tRNA基因的論文。第二節化學合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。①保護dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或堿的脫保護原理1.磷酸二酯法②帶保護的單核苷酸連接保證合成反應的定向進行。帶5’保護的單核苷酸與帶3’保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個保護基團。2.磷酸三酯法3.固相磷酸三酯合成法

將第一個核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。是目前通用的合成方法?；瘜W合成的DNA片斷一般在200bp以內。二、化學合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個片段的5’端帶上磷酸。1.互補連接法預先設計合成的片斷之間都有互補區域，不同片斷之間的互補區域能形成有斷點的完整雙鏈。（2）5’端磷酸化（1）互補配對（合成的DNA單鏈的5’端是-OH）T4DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈預先設計的片斷之間有局部互補區，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3’5’5’3’5’3’T4DNA連接酶Klenow片段引物1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化學合成的優點2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA

3.合成探針序列4.定點突變合成合成帶有定點突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學合成費用較低5.合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor

將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當的載體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。一、基因文庫的構建1.基因文庫（genelibrary）第三節目的基因的保存和擴增（2）目前常用的載體2.構建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的重組子的數目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數目越少，所需的重組子越少。（1）對載體的要求

載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫構建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。

①物理切割法：內切酶Sau3A進行局部消化。可得到10-30kb的隨機片斷。②酶切法：（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內切酶粘性末端片斷。各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數N：所需的重組載體數（克隆數）例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1051.cDNA以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文庫的構建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。（1）不含內含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構建。4.構建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫的特點提取總RNA有商業化的試劑盒（kit）。分離mRNA用商業化的OligodT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）反轉錄酶①cDNA第一鏈合成逆轉錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH堿剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉?。DNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA3’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌?；蚪柚┒宿D移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數（克隆數）1n1n第四節目的基因的分離和擴增一、目的基因的分離1.探針柱分離特異mRNA根據已知的基因序列合成探針，結合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotalmRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補的mRNA結合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR原理：羥基磷灰石柱結合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和分離總mRNA。將表達A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜