植物花粉的制備及體外微結構觀察

植物花粉是植物生長、遺傳、變異特性和功能的基礎。形狀穩定，許多微形狀特征明顯反映了種間的差異和生存信息。它在遺傳和科學研究中具有重要的科學價值。近年來，國內外對物質資源的形態報告主要集中在分類、遺傳和相關方面。隨著人類保護森林資源和生態環境的認識不斷增強，相關科學人員和相關人員越來越重視植物花粉的形態研究。掃描電視圖像具有高分辨率高、視覺效果強、圖像直觀等特點。這是研究花粉形態的好方法。然而，由于對植物花粉的電視圖像技術報道較少，因此采用的方法大多是成本低、周期長的樣品制備技術，難以獲得豐富、準確的植物花粉信息，嚴重影響植物資源形態的深入研究。同時，它也給人一種將植物絲鏡成像技術與之共存的感覺。因此，有必要進一步研究植物花粉的電鏡樣品制備技術。1材料和機器1.1植物花粉的制備隨機采集了4種性能差別較大的植物花粉,分別用不同的樣品制備技術進行制備,并使用容易體現形貌特征的放大倍數,在掃描電子顯微鏡中進行花粉形態和花粉紋飾的觀察.在制備過程中發現,不同植物花粉的壁厚和含水量差別很大,概括為3類:壁薄、含水量大的植物花粉;壁稍厚、含水量較小的植物花粉;壁厚、含水量小的植物花粉.其中,只有壁厚、含水量小的植物花粉可以采用直接粘臺、真空噴鍍或固定后粘臺、真空噴鍍的樣品制備技術.此方法簡單易行,可保持好花粉微細形態特征.但此方法不適宜制備壁薄、含水量大的植物花粉;同樣也不適用于壁稍厚、含水量較小的植物花粉,否則,只能導致花粉結構變形,使種質資源研究得到錯誤信息.試驗材料于2006年在南京林業大學校園內隨機取樣,采集楊樹(Populus)雄蕊、苦竹(Pleioblastusamarus)雄蕊、萱草(Hemerocallisfulva)雄蕊和鵝掌楸(Liriodendrontulipifera)雄蕊,分別抖出花粉.1.2儀器主要儀器有:日立HCP—2臨界點干燥儀;日立IB—5離子濺射儀;菲利蒲SEM—505掃描電子顯微鏡.2測試方法將楊樹、苦竹、萱草和鵝掌楸花粉各分成4份,采用不同的制備技術試驗.2.1牛皮紙制造技術和真空噴錫技術將楊樹、苦竹、萱草、鵝掌楸花粉分別粘臺,離子濺射儀噴鍍,掃描電子顯微鏡觀察.2.2電子顯微鏡觀察將楊樹、苦竹、萱草、鵝掌楸花粉分別浸入3%戊二醛固定2h以上,0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次,酒精梯度脫水,離子濺射儀噴鍍,掃描電子顯微鏡觀察.2.3電子顯微鏡觀察將楊樹、苦竹、萱草、鵝掌楸花粉分別浸入3%戊二醛固定2h以上,0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次,浸入醋酸鈾導電液1h,0.1mol/L磷酸緩沖液清洗2次,梯度脫水,粘臺,離子濺射儀噴鍍,掃描電子顯微鏡觀察.2.4電子顯微鏡觀察將楊樹、苦竹、萱草、鵝掌楸花粉分別浸入3%戊二醛固定2h以上,0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次,鋨酸固定2h,0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次,酒精梯度脫水,醋酸異戊酯置換、臨界點干燥,離子濺射儀噴鍍,掃描電子顯微鏡觀察.3結果與分析3.1花粉的外觀形態及微細結構圖1-1,2為楊樹和苦竹花粉形態.從圖中可見:在高分辨的掃描電鏡中其外觀形態干癟,群體花粉結構全部發生了嚴重變化.圖1-3為萱草花粉的外觀形態,在高分辨的掃描電鏡中,大多數花粉的外觀形態保持良好,只有少數花粉的外觀形態發生了變化.圖1-4為鵝掌楸花粉形態,從圖中可見:其外觀形態和微細結構均保持良好狀態.結果表明:粘臺、真空噴鍍技術不適用于制作壁薄、含水量大的楊樹和苦竹花粉樣品;用于壁稍厚、含水量較小的萱草花粉等樣品的制備也得不到理想的效果;但適合壁厚、含水量小的鵝掌楸等類似花粉的樣品制備.3.2花粉的外觀形態及超微結構圖1-5,6為楊樹花粉、苦竹花粉.從圖1-5,6中可見:其形態有變異,但比采用粘臺、真空噴鍍技術制備的植物花粉樣品得到的結果飽滿一些.圖1-7為萱草花粉的外觀形態.在高分辨的掃描電鏡中外觀形態基本保持良好,但也有少數花粉的外觀形態變化.圖1-8為鵝掌楸花粉和鵝掌楸花粉紋飾,從圖中可見:其外觀形態和超微結構均保持良好狀態.結果表明:固定、粘臺、真空噴鍍技術也不適用于壁薄、含水量大的楊樹、苦竹花粉及壁稍厚、含水量較小的萱草花粉等樣品的制備;但適用于壁厚、含水量小的鵝掌楸花粉樣品制備.3.3花粉的表征圖1-9～12分別為楊樹、苦竹、萱草、鵝掌楸花粉形態,從圖中可見:他們在掃描電鏡中其外觀形態均得到了保持,但分辨率較低,不能在高倍率狀態下觀察清楚花粉紋飾.結果表明:組織導電制備技術可用于植物花粉樣品的低倍觀察;但不適用于植物花粉紋飾和突起的超微結構觀察.3.4花粉的形態特征圖1-13,14為楊樹和苦竹花粉形態.從圖中可見:其外觀形態和超微結構均保持良好狀態.圖1-15,16為萱草花粉的個體形態和紋飾.不僅外觀形態保持良好,紋飾和突起也清晰可見.圖1-17,18為鵝掌楸花粉的個體形態和紋飾.其外觀形態和超微結構均保持良好狀態.結果表明:臨界點干燥技術不但能保持植物花粉的活體形態,還可提供豐富的花粉生存信息和微細結構,是進行種質資源形態研究的優秀手段.4植物花粉樣品制備的原則(1)直接粘臺噴鍍和固定后粘臺噴鍍技術在花粉樣品制備中簡單易行,周期短,成本低,但不能保持含水量大的花粉微細結構,無法滿足于大多數植物花粉的樣品制備需求.只適用于極少數壁厚、含水量小的植物花粉樣品的制備.(2)楊樹、苦竹等花粉的壁薄、含水量大,離開植物機體后,形態迅速發生變化,要保持好樣品的原始形態,需將花粉迅速浸入戊二醛固定液中固定,再采用能夠消除液體表面張力的樣品制備技術,才能保存好花粉的微細結構.(3)植物花粉樣品采用組織導電技術制備,可保持良好形態,但分辨率較低,放大倍率4000倍以上時,很難觀察清楚植物花粉的紋飾和突起.因此,組織導電技術不能體現植物花粉的生存信息和超微結構,不適用于花粉形態的深入研究.(4)通過臨界點干燥技術制備植物花粉,外觀形態保持良好,生存信息