第九節基因工程藥物的

質量控制是利用活細胞作為表達系統，產物的分子量較大，并有復雜的結構，還參與生理功能的調節，用量極微，任何質和量的偏差都可貽誤病情造成嚴重危害。宿主細胞中表達的外源基因，在轉錄翻譯精制工藝放大過程中都可能發生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定質量。一、原材料的質量控制

原材料的質量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質粒純而穩定，以保證產品質量的安全性和一致性。根據質量控制要求應了解以下特性：⒈明確目的基因的來源、克隆經過，并以限制性內切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；⒉應提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及各組成部分（如復制子、啟動子）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物；⒊應提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性；⒋須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結合后的遺傳穩定性；⒌提供插入基因與表達載體兩側端控制區內的核苷酸序列，詳細敘述在生產過程中啟動與控制基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。二、培養過程的質量控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩定；在培養過程中，要求工程菌所含的質粒穩定，始終無突變；在重復生產發酵中，工程菌表達穩定；始終能排除外源微生物污染。生產基因工程產品應有種子批系統，并證明種子批不含有致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產用工作細胞庫。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統的穩定性。對生產種子，應詳細敘述細胞生長與產品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養生產濃度與產量恒定性數據，依據宿主細胞-載體系統穩定性，確定最高允許傳種代數；在培養過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養后的基因型特征；依宿主細胞-載體穩定性與產品恒定性，規定持續培養時間，并定期評價細胞系統和產品。培養周期結束時，應監測宿主細胞-載體系統的特性，如質粒拷貝數、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。

三、純化工藝過程的質量控制

產品要有足夠的生理和生物學試驗數據，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質、DNA與熱源質控制在規定限度以下。在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質、核酸、糖類、病毒、培養基成分及精制工序本身引入的化學物質，并有檢測方法。四、目標產品的質量控制基因工程藥物的質量控制主要包括以下幾項要求:產品的鑒別、純度、活性、安全性、穩定性和一致性。它需要利用生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分子生物學等多學科的理論與技術所建立的鑒定方法。⒈產品的鑒別常用的鑒定方法:電泳方法:SDS、等電聚焦、免疫電泳免疫學方法:放射免疫(RIA)、酶聯免疫(ELISA)受體結合試驗高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分析、圓二色譜、核磁共振⑴肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質,對生成的肽段進行分離分析。它是檢測蛋白質一級結構最有效的方法，該技術靈敏高效是對基因工程藥物的分子結構和遺傳穩定性進行評價和驗證的首選方法。常用HPLC、毛細管電泳。⑵氨基酸成分分析50個氨基酸較理想⑶部分氨基酸序列分析N端15個氨基酸可作為重組蛋白質和多肽的重要鑒定指標。

⑷重組蛋白質濃度測定和相對分子量的測定蛋白質濃度測定方法有:福林-酚法、雙縮脲法蛋白相對分子量的測定:凝膠過濾法、SD-SPAGE法⑸蛋白質二硫鍵分析測定方法有:對氯汞苯甲酸法等5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法⒉純度分析⑴蛋白質含量測定SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細管電泳⑵雜質①蛋白類雜質殘留宿主細胞蛋白采用免疫分析的方法②非蛋白類雜質②非蛋白類雜質非蛋白類雜質主要有:病毒、細菌等微生物、熱原、內毒素、致敏源及DNA。常用檢測方法：雜質和污染物檢測方法內毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細胞蛋白免疫分析、SDS、CE其它蛋白雜質免疫分析、SDS、HPLC、CE殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨酸肽譜、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化肽譜、HPLC、質譜、氨基酸分析產物變性或聚和脫氨基SDS、IEF、HPLC、CE、質譜、凝膠過濾雜質和污染物檢測方法單克隆抗體SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、質譜、CE微生物微生物學檢查支原體