花生種質(zhì)資源的ssr遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

拉蘭氏病是影響民生的主要疾病之一。中國是世界上影響民生的最嚴(yán)重的疾病之一。除引起減產(chǎn)外,青枯病還嚴(yán)重影響花生品質(zhì)并可增加黃曲霉毒素污染。應(yīng)用品種的抗性是防治青枯病最為經(jīng)濟(jì)可行的途徑。雖然我國在花生青枯病疫區(qū)基本普及了抗病品種的種植,但抗病品種的產(chǎn)量水平普遍偏低,而且對其它病蟲害的兼抗性差,品質(zhì)普遍較差,因此抗病品種的缺陷是導(dǎo)致青枯病區(qū)花生低產(chǎn)和低效的主要原因。造成抗青枯病花生品種缺陷的主要原因,除已有抗病育種研究所利用抗源種質(zhì)單一外,育種中抗性主要評價指標(biāo)是發(fā)病條件下的群體成活率,選擇效果受環(huán)境影響大,而且連續(xù)多代群體抗性鑒定費(fèi)時費(fèi)力,限制了抗病育種的規(guī)模,影響了育種進(jìn)展。國內(nèi)外普遍認(rèn)為,分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的有效利用可提高育種效率和縮短育種年限,可實(shí)現(xiàn)多個(抗性)基因的聚合。就花生青枯病而言,若能以分子標(biāo)記技術(shù)鑒定及選擇,可以節(jié)約抗性鑒定的時間和空間,避免環(huán)境條件的干擾,不需要特殊的鑒定(發(fā)病)設(shè)施條件,而且在分離世代直接選擇純合個體,容易獲得“抗病+高產(chǎn)”的基因重組,還可用不同的標(biāo)記檢測不同抗性基因的重組和聚合。因此,建立花生青枯病抗性的分子標(biāo)記,對于深化花生乃至其它作物的青枯病抗性育種具有重要的理論和實(shí)用意義。國內(nèi)外植物抗性分子標(biāo)記已有許多研究報道和應(yīng)用。在花生上,由于早期研究揭示的栽培種花生DNA多態(tài)性較少,因此有關(guān)花生遺傳圖譜的構(gòu)建一般用野生花生為材料。Halward等利用二倍體野生種雜種F2群體構(gòu)建出涉及11個連鎖群包含117個標(biāo)記的RFLP圖譜,圖譜總長度為1032cM。Gacia等利用二倍體野生種雜種回交群體構(gòu)建出RAPD圖譜,并獲得了與線蟲抗性有關(guān)的標(biāo)記。Moretzsohn用二倍體野生種雜交的F2群體為材料,應(yīng)用SSR技術(shù)構(gòu)建了一個包含11個連鎖群204個標(biāo)記的相對較為飽和的遺傳連鎖圖。Burow等用分別含有A、B染色體組的3個二倍體野生種雜交合成異源四倍體,然后與栽培種花生雜交回交群體首次構(gòu)建了涉及栽培種花生的異源四倍體的RFLP圖譜,含23個連鎖群,由307個標(biāo)記組成,圖譜總長度為2210cM。Herselman以栽培種花生之間的雜交后代F2:3中的60個純合個體為材料,通過AFLP技術(shù)首次繪制了一張只涉及栽培種花生的5個連鎖群包含11個AFLP標(biāo)記的部分遺傳連鎖圖,并將與花生叢矮病毒傳媒相關(guān)的標(biāo)記定位于該圖譜的連鎖群上。雷永以栽培種花生雜種F2群體為材料,用AFLP技術(shù)和BSA分析方法,獲得了花生黃曲霉侵染抗性相關(guān)的分子標(biāo)記。重組近交系群體是雜種后代經(jīng)過多代自交得到的一系列高世代家系。由于自交的遺傳效應(yīng)使純合個體增多,雜合個體減少,最后獲得家系內(nèi)基因型純合穩(wěn)定一致、家系間基因型不同的RILs永久性群體,是研究分子標(biāo)記的理想材料。應(yīng)用純合的后代群體進(jìn)行QTL定位,不需要很大的鑒定群體。本研究在已有工作基礎(chǔ)上,通過抗病品種與感病品種雜交,應(yīng)用單粒傳法構(gòu)建重組近交系群體,鑒定重組近交系群體的DNA多態(tài)性和對青枯病的抗性,建立青枯病抗性的分子標(biāo)記,旨在為進(jìn)一步精細(xì)作圖和QTL定位、克隆抗病基因奠定基礎(chǔ),為花生抗病育種的深化提供技術(shù)支撐。1材料和方法1.1fps株行種植以抗青枯病花生品種遠(yuǎn)雜9102與感病品種Chico雜交,F2按單株收獲并于下季種植成F3株行,在F3株行中隨機(jī)收取1株種植成F4,以此類推。F6各株系混合收獲組成重組近交系群體(RILs),共82個家系,供抗性鑒定和DNA標(biāo)記分析,同時繼續(xù)對群體加代。1.2擴(kuò)增dna的構(gòu)建取重組近交系群體及親本苗齡20～30d的幼葉,用SDS-酚/氯仿方法提取DNA。用354對SSR引物(其中204對引物序列由ICRISAT生物技術(shù)實(shí)驗室提供,100對引物序列由廣西農(nóng)科院提供,50對引物序列由互聯(lián)網(wǎng)搜索獲得,所有引物都由上海生工合成)擴(kuò)增基因組DNA,PCR反應(yīng)總體積為10μL,反應(yīng)體系和熱循環(huán)按ICRISAT建立的最佳反應(yīng)體系和熱循環(huán)進(jìn)行,含1×Reactionbuffer,10ng基因組DNA,10pmol引物對,2mMMgCl2,0.15mMdNTPs和1UTaqDNA聚合酶(Bioline)。PCR程序為:94℃變性2min;94℃45s,55～65℃(不同引物的退火溫度不同)1min,72℃1.5min,35個循環(huán);72℃延伸10min。用6%變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物,銀染顯色,電腦掃描。1.3麻黃屬基因的鑒定對于親本多態(tài)性的鑒定,觀察統(tǒng)計為觀察到的DNA片段大小,親本間是否存在多態(tài)性。對于作圖群體的鑒定,觀察統(tǒng)計為A(親本1,P1)、B(親本2,P2)、H(A和B組合)。標(biāo)記與抗性間的交換值按r=交換型個體/(抗病個體+感病個體),遺傳距離(X)=1/4ln[(1+2r)/(1-2r)]。1.4號和高感品種鄂花4號在湖北紅安花生青枯病病圃鑒定RILs群體及親本的抗病性,以高抗品種中花6號和高感品種鄂花4號為對照。單粒播種,單行區(qū)種植,每行播種15～20粒,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計,每隔9行分別設(shè)1行抗病和感病對照,3次重復(fù),青枯病抗性調(diào)查及抗病率(存活率)計算方法和標(biāo)準(zhǔn)按“七五”～“十五”國家科技攻關(guān)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與分析2.1自然病廠的病害鑒定結(jié)果通過鑒定,抗病對照中花6號兩年(2003—2004)多次重復(fù)中均表現(xiàn)為高抗(抗病率達(dá)90%以上),感病對照鄂花4號兩年多次重復(fù)中均表現(xiàn)為高感(抗病率在30%以下),表明該自然病圃具備合適的病害壓力。抗病親本遠(yuǎn)雜9102兩年(2003—2004)多次重復(fù)鑒定結(jié)果均為高抗(抗病率達(dá)90%以上),感病親本Chico的鑒定結(jié)果均為高感(抗病率在30%以下)。重組近交系群體82個家系的F6～F7兩年(2003—2004)6次重復(fù)抗病性鑒定的平均結(jié)果為,47個家系表現(xiàn)抗病(抗病率達(dá)60%以上),35個家系表現(xiàn)感病(抗病59.9%以下)。2.2引物的篩選用354對SSR引物擴(kuò)增親本基因組DNA,獲得能顯示親本遠(yuǎn)雜9102與Chico間多態(tài)性的引物45對,未顯示多態(tài)性的引物242對,沒有獲得擴(kuò)增產(chǎn)品的引物67對。兩親本間的多態(tài)性引物比例為12.71%。2.3青枯病抗性基因多態(tài)性分布用顯示親本多態(tài)性的45對引物擴(kuò)增重組近交系群體基因組DNA,均能獲得清晰穩(wěn)定的多態(tài)性帶。45對引物均能檢測到2個以上多態(tài)性位點(diǎn),均表現(xiàn)為共顯性遺傳。將45個分子標(biāo)記數(shù)據(jù)和由遠(yuǎn)雜9102與Chico雜交獲得的RIL群體(F6和F7)的青枯病抗性鑒定結(jié)果輸入電腦,用Mapmaker/Exp3.0軟件進(jìn)行連鎖遺傳分析。通過骨架連鎖群的構(gòu)建和作圖,獲得了1個包含8個連鎖群的栽培種花生的部分DNA分子標(biāo)記連鎖圖譜(圖1),圖譜總長度為603.9cM,含29個標(biāo)記(28個SSR標(biāo)記和1個形態(tài)標(biāo)記),另外還有17個獨(dú)立的SSR標(biāo)記未能進(jìn)入任何一個連鎖群。從圖1看出,青枯病抗性基因位于第1連鎖群(G1)上,在其兩側(cè)分別有3個(7G02,19C3,4H11)和4個(PM137,14H6,Lec-1和19G7)標(biāo)記分布,連鎖群長度為144.1cM共8個標(biāo)記。其中,7G02和PM137與青枯病抗性基因間連鎖較為緊密,遺傳距離分別為10.9cM和13.8cM。第2連鎖群含5個標(biāo)記(2A05,2D12B,8E12,5D05和2A06),長度為151.4cM。第3連鎖群含2個標(biāo)記(Ah4-06和1B09),距離為35.6cM。第4連鎖群均含4個標(biāo)記(2C11,13E9,16C6和5C12),長度為89.2cM。第5連鎖群的3個標(biāo)記(2G03,3A08和17E01),長度為40.1cM。其中2G03與3A08連鎖較為緊密,遺傳距離為2.6cM,第6連鎖群由2個標(biāo)記組成(13A07和PM375),遺傳距離為34.7cM。第7連鎖群含3個標(biāo)記(PM438,PM201和PM36),長度為73.2cM。第8連鎖群含2個標(biāo)記(10C12和9E8),遺傳距離為35.6cM。從上面的分析看,與花生青枯病抗性相關(guān)的SSR標(biāo)記為7G02和PM137(序列列于表1),位于抗性基因的兩側(cè),與青枯病抗性基因間的遺傳距離分別為10.9cM和13.8cM,兩標(biāo)記間的遺傳距離為24.7cM。對于標(biāo)記7G02,抗病后代表現(xiàn)為150bp,感病后代表現(xiàn)約190bp(圖2)。對于標(biāo)記PM137,抗病后代表現(xiàn)為400bp,感病后代表現(xiàn)約370bp。2.3ril群體中各極端病毒檢測的pcr擴(kuò)增用上述獲得的與青枯病抗性相關(guān)的2個SSR標(biāo)記檢測由中花5號×遠(yuǎn)雜9102獲得的重組近交系群體F6中的19個極端抗病株系和19個極端感病株系的基因組DNA,擴(kuò)增結(jié)果表明,7G02在中花5號×遠(yuǎn)雜9102獲得RIL群體中的18個極端抗病株系中能擴(kuò)增出150bp帶,1個極端抗病株系中擴(kuò)增出190bp帶;在19個極端感病株系中,18個能擴(kuò)增出190bp帶,1個極端抗病株系中擴(kuò)增出150bp帶(圖3)。PM137在18個極端抗病株系中能擴(kuò)增出400bp,1個極端抗病株系中擴(kuò)增出370bp;在19個極端感病株系中,18個能擴(kuò)增出370bp,1個極端抗病株系中擴(kuò)增出400bp帶。從上面的擴(kuò)增結(jié)果看,本研究獲得的SSR標(biāo)記是可靠的。3遺傳圖譜的建立和應(yīng)用本研究應(yīng)用SSR技術(shù)建立與花生青枯病抗性相關(guān)的DNA分子標(biāo)記,通過對大量引物的篩選,獲得能顯示親本差異的SSR引物45對,通過應(yīng)用這些差異引物鑒定RIL群體的多樣性,成功獲得了與花生青枯病抗性相關(guān)的SSR標(biāo)記2個(7G02和PM137),與青枯病抗性基因間的距離為10.9cM和13.8cM,通過應(yīng)用標(biāo)記檢測另外1個重組近交系群體的結(jié)果表明,本研究獲得的標(biāo)記是可靠的,可以應(yīng)用于輔助選擇中。遺傳圖譜的構(gòu)建是研究基因精細(xì)定位和克隆的基礎(chǔ)。Herselman用栽培種花生之間雜交的F2群體中的純合個體為材料,應(yīng)用AFLP技術(shù)首次構(gòu)建了一張只涉及栽培種花生的含5個連鎖群包含11個AFLP標(biāo)記的遺傳連鎖圖。本研究首次用珍珠豆型的栽培種花生與栽培種花生雜交構(gòu)建了RIL群體