微生物菌種的保藏、篩選及誘變技術

實驗4-1降解苯酚微生物的選育實驗4-2紫外線誘變育種實驗4-3微生物菌種的保藏方法實驗4-4蘇云金桿菌的蟲體復壯實驗4-1降解苯酚微生物的選育一、實驗目的

1.學習從含酚工業污水、活性污泥中篩選苯酚降解菌。

2.學習通過活性污泥馴化分離耐酚菌。二、實驗原理酚類化合物是化工、造紙、鋼鐵等工業廢水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死魚蝦、危害莊稼、嚴重危害人類健康，是各國研究關注的污染物之一。含酚廢水中分離出的生物降解酚能力強的菌為：假單胞菌、白乳桿菌、假絲酵母和野絲膜菌等。含酚廢水生物處理目前主要采用活性污泥法。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育三、實驗材料

1.菌源含酚工業廢水或含酚廢水曝氣池中的活性污泥。

2.培養基耐酚真菌培養基(固體、液體和斜面)，耐酚細菌培養基(固體、液體和斜面)，碳源對照培養液a，苯酚培養液b，見附錄Ⅲ。

3.試劑2%4-氨基安替比林溶液，8%鐵氰化鉀溶液，氯仿，氨性氯化銨緩沖液，溴酸鉀-溴化鉀溶液，硫代硫酸鈉溶液,1%淀粉溶液，（見附錄Ⅴ）。

4.其他稀釋分離所用的無菌水，無菌培養皿，無菌移液管，測定酚所用的移液管，容量瓶，試劑瓶，酸式滴定管等。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育四、實驗方法

1.采樣自焦化廠、鋼鐵公司化工廠、造紙廠處理含酚工業污水的曝氣池中取活性污泥和含酚污水，裝于無菌瓶中，帶回實驗室，記錄采樣日期、地點，曝氣池的水質分析包括：揮發酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化學需氧量、焦油、硫化物、氰化物、總氮、氨態氮、磷、pH、水溫等。采集的樣品應迅速稀釋分離。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育

2.分離純化梯度平板制備：在無菌培養皿中，先傾倒7～l0mL不含苯酚的無菌細菌或真菌固體培養基，將培養皿一側置于木條上，使皿中培養基傾斜成斜面，且剛好完全蓋住培養皿底部，待培養基凝固后，將培養皿放平，再倒入無菌7～l0mL(剛好完全蓋住下層斜面)含70mL/l00mL苯酚的無菌耐酚細菌或耐酚真菌固體培養基，剛好完全蓋住下層斜面，放置過夜。由于苯酚的擴散作用，造成上層培養基由厚到薄的藥物濃度遞減的梯度(圖4-1)。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育圖4-1梯度平板

實驗4-1降解苯酚微生物的選育涂布法分離：將采集的樣品按涂布法分離，30℃培養2天后，平板上生長的菌落也形成密度梯度，苯酚低濃度區形成菌苔，苯酚高濃度區出現稀少菌落，將此菌落在含耐酚細菌或真菌培養基平板上連續劃線分離，最后挑取單菌落接種到耐酚斜面培養基上，30℃培養2天。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育

3.耐酚菌馴化先將從含酚廢水采集的活性污泥放入含酚量小于l00mg/L含酚廢水中，添加0.3%MgSO4·7H2O、0.3%KH2PO4，30℃振蕩培養6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰對酚不適應的微生物；再流加含酚廢水，使苯酚濃度增加至200mg/L，30℃振蕩培養4～6天；再提高到流加250mg/L含酚廢水，30℃培養4天，從中選出對酚耐受力強的菌株。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育

4.性能測定。初篩：制備不同含酚濃度的耐酚平板培養基，苯酚濃度為0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，將選出的耐酚力強的的菌株在以上平板培養基上劃線分離，自高酚濃度平板上長出的菌落，即為酚降解力高的菌株。復篩：將初篩純化的菌種分別接入碳源對照培養液a和苯酚培養液b中，30℃振蕩培養48h，0、12、24、36、48h取樣測A600光密度值，繪制生長曲線，以不含酚的碳源(葡萄糖)培養液為對照。若與對照相比，在250mg/L苯酚濃度培養液中生長速度下降不明顯，同時，用4-氨基安替比林法檢測發酵初時發酵液和發酵終止時發酵液苯酚濃度，計算降解率，若苯酚降解率達>80%，表明確系分離到有效苯酚降解菌。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育五、實驗報告

1．記錄分離得到的苯酚降解菌情況于表4-1。

2．根據復篩耐酚試驗，繪制對照組與試驗組生長曲線。

3．記錄在平板上和顯微鏡下觀察的苯酚降解菌的菌落特征和鏡檢特征。

實驗4-1降解苯酚微生物的選育表4-1苯酚降解菌株的降解率菌源菌株不同酚濃度平板生長狀況0.025%0.045%0.060%0.075%菌源菌株苯酚降解率﹤70%71%～80%81%～90%91%～100%返回實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

一、實驗目的

1．掌握紫外線誘發微生物突變的基本原理。

2．學習篩選、檢出和鑒定營養缺陷型突變株的方法。二、實驗原理本實驗以紫外線作為誘變因素，照射時間為60s，用青霉素法將缺陷型進行濃縮。再根據營養缺陷型在基本培養基上不能生長，只能在完全培養基或基本培養基中加有它所缺陷的那種物質才能生長的原理，采用逐個點種法，將營養缺陷型檢出，然后用生長譜法將缺陷型加以鑒定。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

三、實驗材料

1.菌種野生型大腸桿菌（E.coli）。

2.培養基肉湯液體培養基，加倍肉湯液體培養基(2E)，固體完全培養基，基本培養基(固體)，無N基本液體培養基，2N基本液體培養基，見附錄Ⅲ。

3.生長因子類別混合氨基酸和混合維生素的配制（若所用氨基酸為DL型，量需加倍），共分八組（見表4-2）.４.器材培養皿(9cm、6cm)，三角瓶(150mL)，lmL吸管，10mL吸管，離心管(10mL)，帶15W紫外燈管照射裝置，離心機等。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

表4-2混合氨基酸和混合維生素的配制I賴精甲硫半胱胱嘌II組精蘇谷天冬嘧Ⅲ丙甲硫蘇羥脯甘絲Ⅳ亮半胱價羥脯異亮纈Ⅴ苯丙胱天冬甘異亮酪Ⅵ色嘌嘧纈酪Ⅶ脯Ⅷ混合維生素（含多種常用維生素）實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

四、實驗方法

1.誘變處理（1）實驗前14～16h挑取野生型大腸桿菌1環于盛有5mL肉湯的三角瓶中，置37℃培養過夜。（2）第2天添加5mL新鮮的肉湯培養液，充分混勻后，繼續培養5h。（3）取5mL培養好的溶液倒入離心管中，離心(3500r/min，10min)。（4）倒去上清液，打勻沉淀，吸入5mL生理鹽水，制成菌懸液。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

（5）吸上述菌液3mL于直徑為6cm的小培養皿內(皿內放一攪拌子，下為磁力攪拌器)，將培養皿放在15W的紫外光燈下，距離28.5cm。（6）處理前先開紫外燈穩定10min以上，將待處理的培養皿連蓋放入燈下滅菌lmin，然后開蓋在攪拌條件下處理lmin，照射后蓋上皿蓋，再關紫外燈。（7）吸3mL加倍肉湯培養液倒入處理后的培養皿中，放置在37℃溫箱內，避光培養12h以上。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

2.用青霉素法淘汰野生型（1）吸5mL處理過的菌液于已滅菌的離心管，離心10min(3500r/min)。（2）倒去上清液，打勻沉淀，加入生理鹽水，離心洗滌3次，吸生理鹽水到原體積。（3）吸取經離心洗滌的菌液0.1mL于5mL無N基本培養液，37℃培養12h。（4）培養12h后，按1∶1加入2N基本培養液5mL，稱取青霉素鈉鹽，使青霉素在菌液中的最終濃度約為500u/mL，再放入37℃溫箱中培養。（5）從培養12，16，24h的菌液中，各取0.1mL菌液到預先倒好的基本培養基和完全培養基的平板中涂皿。放入37℃溫箱中培養。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

3.缺陷型的檢出（1）以上平板培養36～48h后，進行菌落計算，選用完全培養基上長出的菌落數大大超過基本培養的那一組，用無菌牙簽挑取完全培養基上長出的菌落100個，分別點種于基本與完全培養基平板上，先基本后完全，于37℃溫箱培養。（2）培養12h后，選在基本培養基上不長，完全培養基上生長的菌落，在基本培養基的平板上劃線復證。37℃溫箱培養，24h后不生長的可能是營養缺陷型，便可用于鑒定。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

4.生長譜鑒定（1）將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5mL肉湯培養液的離心管中，37℃培養14～16h。（2）培養16h后，以3500r/min離心l0min，倒去上清液，打勻沉淀，然后離心洗滌三次，最后加生理鹽水到原體積。（3）吸取經離心洗滌的菌液lmL于滅菌的培養皿中，然后倒入熔化后冷至40～50℃的基本培養基，搖勻放平，待凝，共做兩皿。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

（4）將兩只培養皿的皿底，等分8格，依次放入混合氨基酸，混合維生素和核酸堿基混合物，然后放入37℃溫箱培養24～28h。整個實驗過程參見圖4-2。五、實驗報告觀察生長圈，確定是哪種營養缺陷型。實驗4-2利用紫外線誘變篩選營養缺陷型突變株

圖4-2紫外線誘變篩選大腸桿菌營養缺陷型突變株流程圖返回實驗４-３微生物菌種的保藏方法

一、實驗目的了解并掌握菌種保藏的常用方法、基本原理及其應用。二、實驗原理菌種保藏的原理是微生物在低溫、干燥、缺氧的條件下會降低代謝活動，使細胞處于休眠和代謝停滯狀態，從而能夠較長期地保藏菌種，并能推遲細胞退化，降低菌種的變異率。常用的保藏方法包括斜面傳代保藏法、穿刺保藏法、液體石蠟保藏法、砂土管保藏法等。這些方法操作簡便易行，不需要特殊設備，為一般實驗室及生產單位廣泛采用。實驗４-３微生物菌種的保藏方法

三、實驗材料

1.菌種細菌、放線菌、酵母菌、霉菌斜面菌種。

2.培養基牛肉膏蛋白胨培養基，高氏1號培養基，馬丁氏培養基，馬鈴薯葡萄糖培養基。

3.試劑10%HCl，篩子，無水氯化鈣，醫用液體石蠟（比重0.83～0.89），河沙，瘦黃土（含有機物少的黃土）。

4.器材干燥器，40目及100目無菌篩子，無菌試管，無菌移液管（1mL及5mL），接種環，接種針，無菌滴管，超凈工作臺，恒溫培養箱，高壓蒸汽滅菌鍋。實驗４-３微生物菌種的保藏方法

四、實驗方法

1.砂土管保藏法此法僅適用于保藏產生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌或霉菌等。

(1)無菌砂土管制備①河砂處理取河砂1000～1500g，用40目篩子過篩，除去大的顆粒。再用10%HCl溶液浸泡，除去有機雜質，鹽酸用量應浸沒砂面，約浸泡24h，倒出鹽酸，用自來水沖洗至中性，烘干。用磁鐵石除去黃砂中的鐵質。②篩土取30cm以下的較貧瘠非耕作層的黃土若干，自來水沖洗至中性，烘干磨細，用100目篩子過篩。實驗４-３微生物菌種的保藏方法

③砂和土混合砂和土以1∶1或3∶2混合均勻，裝入100mm×10mm小試管中。裝量約1cm高即可，塞上棉塞，包上牛皮紙。④滅菌高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌1～1.5h。每天一次，連續滅3d。在50℃以下烘干。⑤無菌檢查取滅菌后的砂土少許，接入牛肉膏蛋白胨培養液中，37℃培養1～2d，觀察有無雜菌生長。如有，則需重新滅菌。實驗４-３微生物菌種的保藏方法

（2）制備菌懸液首先使斜面菌體生長健壯，孢子飽滿，吸取3～5mL無菌水至1支已培養待保藏的菌種斜面中，用接種環輕輕刮下孢子或菌苔（注意不要帶入菌絲和培養基），使成菌懸液，細胞濃度為108～1010mL-1。（3）加樣用無菌吸管吸取菌懸液，在每支砂土管中滴加4～5滴菌懸液，用接種環拌勻，塞上砂土管棉塞。（4）干燥將已滴加菌懸液的砂土管置于干燥器內。干燥器內應預先放置無水氯化鈣用于吸水。當無水氯化鈣因吸水變成糊狀時則應進行更換。如此數次，砂土管即可干燥。有條件時，也可用真空泵連續抽氣約4h，即可達到干燥效果。實驗４-３微生物菌種的保藏方法

（5）抽樣檢查從抽干水分的砂土管中，每10支抽取1支進行檢查。用接種環取少許砂土，接種到適合于所保藏菌種生長的斜面上，并進行培養。檢查有無雜菌生長及所保藏菌種的生長情況。（6）保藏若經檢查沒有發現問題，可將砂土管繼續放在干燥器內（干燥器底部盛有硅膠、石灰或五氧化二磷等物），用橡皮塞或棉塞塞住試管口，并置于室溫或4℃冰箱保存。也可用真空泵抽干水分后火焰封口。實驗４-３微生物菌種的保藏方法

2.斜面保藏方法（1）貼標簽在標簽紙上寫明接種的細菌菌名、培養基名稱和接種日期，貼在試管斜面正上方距離試管口2～3cm處。（2）斜面接種將待保藏的菌種用斜面接種法接種在已注明菌名的試管斜面上。（3）培養細菌置37℃恒溫箱中培養18～24h，酵母菌置28～30℃恒溫箱中培養26～60h，放線菌和絲狀真菌置28℃培養4～7天。（4）保藏斜面長好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。這種方法一般可保藏三個月至半年。

實驗４-３微生物菌種的保藏方法

3.液體石蠟保藏法（1）液體石蠟滅菌將液體石蠟置于100mL的小錐形瓶內，每瓶裝10mL，塞上棉塞，外包牛皮紙，高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌30min。滅菌后將裝有液體石蠟錐形瓶置于105～110℃的烘箱內約1h，以除去液體石蠟中的水分。（2）接種將菌種接種至適宜的斜面培養基上。（3）培養在適宜溫度條件下培養，使其充分生長。（4）加液體石蠟用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入到已長好菌的斜面上，液體石蠟的用量以高出斜面頂端1～2cm左右為宜，使菌種與空氣隔絕實驗４-３微生物菌種的保藏方法

（5）保藏將已注入液體石蠟的斜面培養物直立，置于4～5℃冰箱或室溫下保存。（6）轉接到保藏期后，需將菌種轉接至新的斜面培養基上，培養后再加入適量滅菌液體石蠟，進行保藏。注意：從液體石蠟下面取培養物移種后接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺。五、實驗報告記錄各種菌種保藏的方法和結果。返回實驗4-4蘇云金桿菌的復壯

一、實驗目的學習從病蟲體內復壯病原菌的一般方法。二、實驗原理蘇云金桿菌及其變種殺螟桿菌、青蟲菌和松毛蟲桿菌等都是昆蟲的致病細菌。將它們經過固體或液體培養基大量培養后，可收集其菌體并添加適量的填充料如碳酸鈣等，以制成殺蟲菌粉。它對玉米螟、稻苞蟲、粘蟲、松毛蟲、棉鈴蟲和菜青蟲等幾十種鱗翅目昆蟲的幼蟲均具有很強的感染力。實驗4-4蘇云金桿菌的復壯

生產菌種經過若干代之后往往會出現菌種衰退，表現為產芽孢或伴孢晶體的數量越來越少，體積變小，毒力下降等。為了保證生產菌種能保持較強的毒力和原有的性狀，就要進行經常性的菌種復壯工作。對于殺蟲菌來講，復壯就是用原來生產菌種制成懸浮液，然后將它拌到飼料中飼養昆蟲(選健壯的3齡幼蟲)，待昆蟲死后再從蟲體內重新分離出蘇云金桿菌。如此重復4～8次即可得到毒力強的菌種。另外，也可從自然界死亡蟲體中分離菌種。實驗4-4蘇云金桿菌的復壯

三、實驗材料

1.培養基牛肉膏蛋白胨培養基。

2.器材顯微鏡，無菌培養皿，無菌三角瓶(內裝玻璃珠)，鑷子，解剖針，無菌滴管等。

3.試劑75%乙醇，5.25%次氯酸鈉(即漂白粉)，10%硫代硫酸鈉。四、實驗方法

1.制備菌液將菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，置30℃恒溫培養24h后，用無菌水洗下菌苔制成孢子懸液。實驗4-4蘇云金桿菌的復壯

2.感染昆蟲將上述菌液滴加在喂飼昆蟲的葉片上，晾干后任昆蟲(挑選健壯的3齡幼蟲)取食，然后將蟲子放25℃恒溫條件下飼養，待昆蟲死亡后采集死蟲。

3.采集死蟲瀕于死亡的昆蟲幼蟲停止取食后，口吐褐色體液，排泄稀糞于葉片或其他附著物上，部分或大部分的蟲體開始變為褐色。由于細菌在蟲體內大量繁殖，結果使幼蟲的體壁變得薄而易破，因此采集時要特別小心。將采集來的昆蟲放在無菌培養皿或無菌小瓶中。如果死蟲緊貼在粘附物上可連同基物一起采集。實驗4-4蘇云金桿菌的復壯

4.蟲體表面消毒為防止消毒溶液滲入體腔，應用棉線結扎蟲體的口腔和肛門。將蟲體浸入75%乙醇中，浸數秒鐘后即移入含5.25%漂白粉的溶液中，浸3～5min，再將蟲體轉入10%硫代硫酸鈉溶液內浸3～5min，以除去游離的氯，最后用無菌水沖洗蟲體