雞堆型艾美耳球蟲的分離鑒定

雞球蟲是影響雞場健康發展的最重要寄生蟲。蠕蟲是1929年飼養雞場最常見的昆蟲之一，分布廣泛。為對堆型艾美耳球蟲的生物學特性有進一步的了解,我們從長春市區某雞場采集的混合感染球蟲樣品中,分離獲得了堆型艾美耳球蟲純種,并對其致病性進行了觀察,建立的純種毒株既為藥物的療效試驗和免疫研究中的提供攻毒蟲體,也為球蟲致弱苗研究提供原代種蟲。本文就來自長春市堆型艾美耳球蟲純種的分離鑒定和致病性觀察情況進行報道。1材料和方法1.1球卵囊的分離培養從長春市某雞場死于球蟲病的雞腸道內容物中,按常規方法分離出球蟲卵囊,加入2.5%重鉻酸鉀溶液置于29℃恒溫培養箱中,培養至孢子化,獲得混合球蟲卵囊。1.2試驗動物海蘭公雞,購自長春市農業科學院。出殼后運回實驗室,飼養在經火焰消毒的籠具中。飼料、飲水、食槽等用具均高溫消毒。1.3引物、培養、分離取混合種卵囊液離心洗凈重鉻酸鉀,計數,按每只雞1個孢子化卵囊經口接種于10日齡雛雞,接種后7d剖殺雞,取十二指腸和小腸前段內容物,分離卵囊,培養至孢子化備用。1.4個卵囊的確定和喂給參照黃兵等報道方法,制備1%的瓊脂,溶解后澆在載玻片上,厚約1.5mm。用牙簽沾取初次分離卵囊稀釋液輕輕涂在瓊脂塊表面,在10×10倍鏡下確定為單個卵囊時,后用自制的安裝在顯微鏡上的打孔器切割瓊脂,用細針頭將切割的小塊瓊脂移置另一載玻片上,再次用10×40鏡檢確定單個卵囊后,經口喂給2日齡無球蟲雛雞,并滴入1-3滴蒸餾水,促其吞咽。感染后5d逐只查糞便,發現卵囊即為單卵囊后代,分離培養至孢子化。1.5腸道生殖發育特點對單卵囊繁殖的后代,接種無球蟲雛雞進行增殖,并根據其在腸道寄生部位、肉眼病變、潛伏期(卵囊最早排出時間),卵囊最短孢子化發育時間。卵囊和孢子囊的大小、形狀、結構等指標。對照國內外文獻,確定蟲種,進行繁殖。1.6組堆型艾美爾球蟲子化卵囊感染后1周后情況比較選擇2周齡無球蟲感染、體重相近的海蘭公雞50只,隨機分成5組,即1個不感染組和4個感染組。除不感染組外,其余4組,每只口服感染1×104,2×104,5×104和10×104個堆型艾美爾球蟲孢子化卵囊。感染后1周結束試驗,以平均增重、死亡率、病變記分作為試驗指標,并對各組增重進行統計學比較。腸道病變記分參照Johnson和Reid(1970)標準。2結果2.1感染雞卵囊的鑒定分離獲得的球蟲主要寄生在十二指腸和小腸前段,致病力中等,引起腸壁增厚。嚴重感染時亦擴展到小腸,從十二指腸到小腸前段漿膜面可見到成片多量灰白色橫紋狀白斑,外觀呈現階梯狀,腸黏膜面和漿膜面有大量的出血點。腸內含有大量粘稠的分泌物。取腸內容物和腸黏膜刮取物鏡檢,卵囊為卵圓形,卵囊壁光滑,呈淡綠黃色,囊壁分二層,厚約1.01μm。卵囊窄端內壁變薄,形成極孔,1個折光性強的極粒在其附近,少數2個,無卵囊殘體。測200個卵囊的平均大小為(13.5-21)×(11-17.5)μm,平均為17.5×14.5μm,形態指數為1.21。測200個孢子囊大小為(4.6-9.5)×(3.5-6.5)μm,孢子囊有斯氏體,無殘體。用此卵囊人工感染雛雞,在感染后97h糞中查到少量卵囊,此卵囊在2.5%重鉻酸鉀溶液中,置于29℃恒溫培養18h,見到孢子化完全的卵囊,并感染雛雞獲得成功。根據上述結果,對照國內外文獻,確定該種為堆型艾美耳球蟲(EimeriaacervulinaTyzzer1929)。2.2疾病觀察2.2.1雞的一般情況感染初期,各組試驗雞精神、飲食欲無明顯的異常。感染后84h,接種堆型艾美耳球蟲卵囊5×104和10×104兩組雞表現為飲食欲減少,羽毛逆立,糞便變稀,其它組試驗雞無明顯癥狀;感染后144h,感染各組均出現明顯的臨床癥狀,糞便開始變稀不成形,帶有大量粘液,部分試驗雞糞便帶血。除感染10×104組雞死亡2只外,整個試驗其它各組雞未發生死亡。2.2.2組患者各感染組間比較試驗各感染組雞在感染后7d內的平均增重量不一,試驗各感染組的平均增重都不同程度地低于對照組。統計結果表明,1×104、2×104組與對照組之間差異顯著(P<0.05),5×104和10×104組與對照組之間差異極顯著(P<0.01)。各感染組間相比,1×104、2×104組與5×104和10×104組之間差異顯著(P<0.05)。由此可見堆型艾美耳球蟲對增重影響比較明顯,隨著感染劑量的增加,增重明顯減少。2.2.3腸道病變的程度試驗各組感染雞,病理剖檢均觀察到不同程度的腸道病變,隨著感染劑量的增加,病灶數量也相對增多,十二指腸和小腸前段腫脹,粘膜明顯增厚。病變記分結果見表1。3種球蟲屬e.常見艾美耳球蟲3.1堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)顯著的特征是寄生在十二指腸和小腸前段,嚴重感染時漿膜面可見到成片多量灰白色橫紋狀白斑,外觀呈現階梯狀。我們分離獲得的這株球蟲具有此特征,其卵囊結構、測得的卵囊和孢子囊大小、卵囊形狀指數、潛隱期和孢子發育最早時間均在文獻記錄的范圍。因此,可鑒定這株純種球蟲為堆型艾美耳球蟲(EimeriaacervulinaTyzzer1929)。3.2堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)的致病性在不同地方株之間有明顯差異。本次分離獲得的純種堆型艾美耳球蟲,是雞場最常見的球蟲種類之一,有一定的致