七個步驟教你通過反應曲線排查生化儀系統誤差目前生化檢驗工作中自動化分析儀的應用十分普遍，自動化分析取代了費時費力的手工操作，既提高了工作效率又便于生化檢驗標準化，大大推動了生化檢測的發展。生化反應曲線分析是每一個使用全自動生化儀的檢驗人員都應該必備的技能，通過反應曲線可快速有效地查找分析生化檢測中誤差、失控產生的原因，可幫助發現隱匿型失控如超出線性范圍，然后有針對性地找到解決問題的方法，從而保證檢驗結果的準確、有效。下圖是一個動力學零級反應雙試劑的正常反應曲線（以GGT的一個正常曲線為例），今天我們就通過這個例子和大家共同學習一下全自動生化分析儀的反應曲線：圖1.動力學法零級反應（動態監測法）雙試劑的反應曲線反應曲線概述反應曲線的縱坐標為吸光度，注意這里的數值是真正的吸光度乘以10000,上圖中吸光度為100的實際吸光度應該是0.01A。反應曲線的縱坐標間隔，不同廠家的試劑和生化項目上都是不固定的，所以僅僅從反應曲線我們無法確認吸光度的波動是否超限，必須配合上相應的反應數據才能進行確認。反應曲線的橫坐標為測量周期，根據參數有不同測量周期一般為8-12秒。不同反應階段我們把一個正常的雙試劑反應曲線可以認為地分為6個部分，如圖中所示：A點加入試劑1（RI）;B段RI升溫；C點加入樣本（S）;D段S+Rl孵育時間；E點加入R2（試劑2）；F段反應開始直到結束。單試劑的測試與雙試劑相比只是少了D、E兩步。A點加人試劑1反應曲線測試周期為0的一點為杯空白，在A點即第1個測試周期，試劑l加入反應杯中，這一點的吸光度應該為試劑1的試劑空白。這一點和杯空白不同，所以第一點是杯空白，第二點是試劑空白。針對不同的試劑，A點的吸光度會有不同，我們要認真閱讀試劑說明書。例如ALT的第一試劑中含有主要的吸光物質NADH，而試劑說明書中對試劑空白的要求是必須大于1.0,這就決定了A點的吸光度在圖中的縱軸應該在10000以上，常見的應該在17000到20000之間；而Y—GT的第一試劑中并不含任何主要的吸光物質，試劑說明書當中對試劑空白的要求是小于1.3。如果一旦出現吸光度不滿足試劑的性能要求，可以考慮試劑失效（請丟棄）；另一方面，大部分設備的吸光度檢測范圍都不超過2.5，因為生化儀的檢測原理為Lambert-Beer定律，它只適合于均勻非散射的低濃度介質，一般比色法測量值推薦的吸光范圍在0.3-0.7以內，如果A點的吸光度達到了50000以上（唯一例外的是CO2的試劑要求是不小于1.2A），要考慮是否有可能在反應杯中出現了污染物或者氣泡，此時取出相應的反應杯進行肉眼觀察是最好的辦法。B段試劑1升溫試劑一在升溫的過程中吸光度應該是沒有什么變化的，其中某些試劑在此過程中吸光度會緩慢上升共計200（0.02A）左右也是有的，但是連續的兩個檢測周期吸光度的波動范圍正常的是在20以內。如果遠遠超過這個限制，比如100以上，要考慮：a）反應杯中有干擾因素：常見的是氣泡或杯子不干凈。可以通過肉眼觀察進行驗證。同時這種波動也局限于個別杯子中，其他大部分杯子會是好的。b）采集時間和光路配合不好：常見的是光電采集位置參數變化或反應盤轉動不穩定。這種波動會在幾乎所有的杯子中出現。而且波動的程度也相對較大。c）光路本身不穩定：常見原因是光源燈老化。光源燈使用2000小時以上便無法再保證性能。可以通過更換光源燈進行確認。C點加入樣本在加入樣本的一瞬間，由于樣本本身是有顏色的，必然導致這一點吸光度的上升。根據樣本顏色的深淺這一點的吸光度會比之前一點（加入樣本之前）升高200到1000左右，唯一的例外是我們用蒸餾水作樣本的時候，吸光度反而會下降200左右。如果我們在反應曲線或者反應數據中可以清楚的觀察到這一點的吸光度變化，我們就可以確認樣本是加進反應杯中了。同時比較重復性測試的幾個相同測試的反應曲線變化值。我們就可以大致確認樣本的加入量是否一致。樣本加入出現的問題一般是由于樣本針甩樣、樣本針液面檢測故障、液路泄漏、樣本注射器位置不固定導致的加樣量不足。D段S+RI孵育時間這段時間里，樣本和試劑一在37弋的環境下會進行孵育的反應。從而吸光度會有一些變化，根據項目的不同，變化的情況會不一樣，但是基本上變化的程度都不大，而且這段的反應曲線應該是平穩的或者是連續變化的。如果出現明顯的波動（相鄰的采樣周期吸光度波動超過50），要考慮是否攪拌桿有打杯的情況。E點加入試劑2加入試劑2的瞬間．理論上這一刻的吸光度應該是雙試劑的試劑空白+樣本光吸收的吸光度的和，但是由于儀器的檢測時間和加入試劑的時間有一定的延遲，導致吸光度偏離我們的理論值（加入時反應就開始了但是周期檢測不一定馬上檢測了）。盡管有一定的偏差，這一刻的吸光度應該依然會有一個合理的變化。比如ALT是一個吸光度下降的反應，第二試劑中沒有NADH，而總體積變大，所以在加入第二試劑這一刻，吸光度應該比D段有一個明顯的下降；而Y—GT是一個吸光度上升的反應，第二試劑中的有效成分會導致吸光度呈現一個明顯的上升。如果E點的吸光度沒有變化，我們可以考慮第二試劑是否沒有加入。如果E點的吸光度變化太大，比如升到50000以上，我們必須考慮是否有可能是試劑加入過程中產生了氣泡或者有污染物帶入。當然，攪拌桿打杯也會導致類似的情況。F段反應開始直到結束這一階段是連續監測法線性反應期（一般酶活力的監測方法），這時的曲線變化完全取決于當前測試的方法。終點法、動力學法、固定時間法都應該符合各自典型的反應曲線，同時要注意說明書中對反應上升和下降的描述．如果出現與預期的方法學和反應方向完全不匹配的反應曲線．我們要考慮是否試劑失效、試劑擺放錯誤、對試劑說明書解讀錯誤。這一段反應曲線是生化儀獲得反應度并計算出濃度的基礎，如果這段反應曲線出現不正常的波動，常常會導致結果的錯誤常見錯誤有：a） 反應度不足：比如葡萄糖的測試，作為終點法，F段最后一點的吸光度和D段后端的吸光度的差值就是我們要測量的反應度。5.55g/L的反應度應該在0.3A這個數量級，從反應曲線上看吸光度的變化量應該在3000以上，如果出現反應度在不同的數量級，比如500或者20000，都應該考慮是否試劑失效或其他異常情況。b） 反應曲線波動：除了試劑樣本的加入以外任何時候反應點的狀態應該是穩定變化且平滑的反應曲線的波動應該不會大于20，由于不同的試劑配方和反應的不盡相同，很難給出一個確定的值來界定波動的范圍。但是一般測試的波動如果大于100，就很有可能會有問題。例如攪拌桿打杯、氣泡等等。同時，由于各個測試的反應度不同，吸光度的波動對測試的影響就不盡相同。反應越小收到的影響越大，當攪拌桿打杯引起的吸光度波動一般在50到300之間，對于葡萄糖（反應度為3000以上）就影響很小，但是對總膽和直膽的影響就很大，因為這兩個項目在使用雙試劑的時候反應度只有300左右。所以我們在檢查儀器狀態的時候，除了看結果，一定要看的是反應曲線的波動情況。結語檢驗工作一旦出現失控必須進行失控分析。產生失控的原因很多可能是隨機誤差也可能是系統誤差。針對于全自動生