植入前遺傳學診斷新進展

preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)′s latestprogress

主講：吳振楠2009041101組員：王芳，吳明瑤PGD的定義，應用及分類植入前遺傳學診斷(preimplantationgeneticdiagnosis/PGD)是輔助生殖技術與遺傳學診斷技術相結合的一種植入前診斷技術，為遺傳病高危夫婦提供盡可能大的選擇范圍，把對某些疾病發現和診斷的時機提前到胚胎發育的最早階段，阻斷一些單基因疾病及染色體異常疾病的發生是輔助生殖技術的一個重要方面。PGD的常規方法目前應用于PGD的常規方法有聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)和熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization．FISH)常用的PCR類型有巢式PCR、多重PCR、熒光PCR、熒光定量PCR等。PCR擴增后，用于后續基因診斷的方法主要有：①根據特異性目的條帶的有無做出診斷，主要用于由基因缺失而引起的疾病的診斷。②多態性分析，即在致病基因附近尋找幾個與其緊密連鎖的DNA多態性位點。通過連鎖分析進行診斷和攜帶者檢測。③等位基因寡核苷酸特異探針(allele．specificoligonucleotide。ASO)斑點雜交及反向斑點雜交(reversedotblot，RDB)。④單鏈構象多態性(single．strandconformationpolymorphismanalysis。SSCP)及變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)等FISH是用帶有熒光標記的特異性探針與染色體結合后，在熒光顯微鏡下觀察特定染色體的情況。常用于PGD的FISH探針有染色體記數探針(CEP)、染色體特異單一序列探針(CSI)等，針對不同的需要可以選用不同的探針。除了上述方法外，一些新方法、新技術不斷出現并應用到臨床PGD中。一、微陣列比較基因組雜交二、微測序技術三、多重置換擴增一、微陣列比較基因組雜交微陣列比較基因組雜交(comparativegenomiehybridization，CGH)CGH原理是提取待測與對照基因組DNA，標記不同熒光后以1：1的比例混合，與正常人中期染色體雜交。根據熒光的不同判定待檢測基因組中對應序列拷貝數的改變。CGH可檢測出一些不常見的異常，如5號與9號染色體三體，其發生率在l000次自然流產中不足1％。這也間接說明，一些未被識別的非整倍體異常同樣對胚胎的發育具有致死性。CGH在PGD的應用有兩種方式：單卵裂球CGH和第一極體CGH.因CGH需要3-4d才能出結果，考慮到體外受精治療周期中的移植窗口期限制,擬施行CGH的卵裂球在活檢后就需要對胚胎進行凍存，因此凍融后胚胎存活數目的下降是目前單卵裂球CGH的主要缺陷（缺點）。而第一極體在胞漿內配子注射后取出，即當日，這樣便有足夠時間等待CGH結果以挑選正常卵母細胞受精的胚胎。這種對卵母細胞間接的細胞遺傳學分析，可檢出在減數分裂I期分離過程異常造成的非整倍體，如三倍體或單倍體等，這也正是造成早期流產的主要原因。第一極體CGH雖然避免了胚胎凍融（優點），但對第一極體的檢測不能檢測卵母細胞減數分裂Ⅱ期及精源性異常。此外，第一極體CGH不能檢測出嵌合性胚胎，但通過對第二極體的檢測則能部分彌補這點缺陷。（缺點）二、微測序技術微測序技術，又稱為單核苷酸引物延伸法(singlenucleotideprimerextension，SnuPE)，是一種有多種用途的新技術，已經廣泛應用于法醫學、人口遺傳學等領域。其原理是設計一對針對突變位點的特異性引物，退火后直接結合于突變位點附近，同時加入與野生型及突變型模板互補的一種熒光雙脫氧核苷酸，分別用不同的顏色標記4種雙脫氧核苷酸，經過多輪的延伸與鏈終止過程，產生許多帶有熒光標記的核苷酸片段，經毛細管電泳從而實現對模板序列的推導。微測序技術具有快速、敏感的特點，結合毛細管電泳技術可以一次實現對多個突變位點的檢測而實現高通量分析。微測序技術開始主要用于檢測單核苷酸多態性(·singlenucleotidepolymorphism，SNP)的突變位點。三、多重置換擴增多重置換擴增(multipledisplacementamplification，MDA)MDA是一種基于酶促反應而不依賴熱循環的DNA體外等溫擴增技術，可用于質粒、細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC)及全基因組DNA的擴增。認為用MDA進行全基因組擴增(wholegenomeamplification，WGA)是當前效率最高的全基因組擴增方法。基因組中不同位置的各個位點都能通過MDA實現相似的擴增效率。Hellani等報道首例應用MDA診斷地中海貧血及囊眭纖維化的PGD。后來用于其他疾病的報道逐漸增多，如Marfan綜合征等。MDA的缺陷有嵌合性DNA重排，包括序列倒位、序列重新拼結等。用于PGD時，MDA的主要缺點是等位基因脫手13(alleledropout，AD