阿司匹林丁香酚酯抗炎作用及其機制研究

近年來，從解熱鎮痛到抗炎、抗風濕、抗血小板聚集和抗癌的臨床應用越來越廣泛和重要，但長期使用對胃腸損傷的損害也越來越明顯。因此,為了消除其不良反應,避免阿司匹林中羧基對胃腸道的刺激,減輕該藥對胃腸道的直接損傷,筆者將阿司匹林的游離羧基與丁香酚(eugenol)結合,屏蔽了游離羧基,形成一種新的酯類化合物——阿司匹林丁香酚酯(aspirineugenolester,AEE),理論上該化合物具有明顯的優勢,可降低阿司匹林的酸性對胃腸的不良反應,以及丁香酚的刺激性和易氧化性,同時未改變發揮臨床作用的結構部位。急性毒性實驗結果表明,實驗大鼠解剖未見胃腸道出血和潰瘍等不良反應,AEE的LD50為10.39g·kg-1,阿司匹林的LD50為1.5g·kg-1,丁香酚的LD50為2.68g·kg-1,AEE較兩種前體藥具有明顯的低毒優勢,提示AEE已達到降低毒性的目的。為了研究AEE是否具有2種前體藥的藥效,本研究觀察了AEE的抗炎作用,并初步探討其可能的作用機制,以期為AEE的臨床應用提供實驗依據。1小鼠足跖水腫實驗1.1動物、藥品、試劑和儀器昆明種小鼠,雌雄兼用,體質量18~22g,由蘭州大學提供。飼養環境:溫度18~25℃,濕度50%~60%。AEE:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所新獸藥工程重點實驗室制備,HPLC法測定其純度>99%;丁香酚:江西匯通藥用香料油有限公司,純度>99%;阿司匹林:武漢合中化工制造有限公司,純度>99.9%。二甲苯等化學試劑:國產,分析純。721紫外分光光度計:上海分析儀器廠;LS55型熒光分光光度計:PerkinElmer公司。1.2阿司匹林丁香酚酯、阿司匹林和丁香酚混懸液的制備實驗前用濃度0.5%的羧甲纖維素鈉溶液配制AEE5和10g·L-1混懸液及阿司匹林10g·L-1的混懸液;將丁香酚與吐溫80以2∶1比例混合,加入一定量生理鹽水,配制成8g·L-1的混懸液,在漩渦振蕩器上充分混勻后密封保存。1.3二甲苯致小鼠耳腫脹測定小鼠50只,隨機平均分為5組:模型組(灌服0.5%的羧甲纖維素鈉)、阿司匹林0.2g·kg-1組、丁香酚0.18g·kg-1組、AEE0.18和0.36g·kg-1組,小鼠ig給予相應藥物,每天1次,連續3d。于末次給藥1h后麻醉,二甲苯50μl涂于小鼠右耳郭兩面,60min后處死小鼠,用打孔器打下雙耳同一部位耳片稱重,計算耳郭的腫脹度和腫脹抑制率。腫脹度=右耳片重量-左耳片重量;腫脹抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。1.4小鼠腹腔毛細血管通透性測定小鼠50只,給藥處理同1.3。末次給藥1h后尾靜脈注射0.5%依文思藍生理鹽水溶液10ml·kg-1,同時ip給予0.6%醋酸10ml·kg-1。1h后處死,用6ml生理鹽水反復沖洗腹腔,收集沖洗液并稀釋至10ml。1000×g離心15min,取上清液于紫外分光光度計590nm處測定A590nm,以A590nm反映毛細血管的通透性。1.5角叉菜膠致小鼠足跖腫脹實驗小鼠180只,隨機平均分為6組:正常組及模型組(灌服0.5%的羧甲纖維素鈉20ml·kg-1)、阿司匹林0.2g·kg-1組、丁香酚0.18g·kg-1組、AEE0.18和0.36g·kg-1組,給藥處理同1.3。末次給藥后1h,除正常對照組外其他所有小鼠右后足跖皮內注射1%角叉菜膠0.03ml,4h后脫頸椎處死小鼠,沿踝關節上的標記線剪下左右后足,以左右后足重量差為足腫脹度,計算腫脹抑制率:腫脹抑制率(%)=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。1.6小鼠棉球肉芽腫的檢測小鼠50只,分組同1.3。在無菌條件下,于小鼠腋窩部皮下手術植入一個(10±1)(x±s)mg的滅菌青霉素棉球,術后每天ig給藥1次,連續7d。7d后處死小鼠,剝離棉球,60℃烘箱內烘干稱重,計算小鼠平均每10g體質量增生的肉芽腫質量(mg)。1.7角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠致炎足組織中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)含量的測定取1.5處理小鼠,每組10只,剪下致炎后足,稱重,剪碎后分別浸入盛有2.5ml生理鹽水的試管中,振搖2h后取出,將浸泡液1000×g離心15min,取上清液0.3ml于另一試管內,加入0.5mol·L-1KOH甲醇溶液1.0ml,50℃水浴20min異構化,加甲醇2.5ml,測定A278nm值,用A278nm值表示PGE2含量。1.8角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠致炎足組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的測定取1.5處理小鼠,每組10只,剪下致炎后足,稱重,剪碎后分別置于0.45ml20%的三氯醋酸中浸泡4h后棄炎足,在浸泡液中加入0.55mlTBA液(含1%硫代巴比妥酸的鹽酸0.1mol·L-1)混勻,90~95℃水浴15min后加2ml生理鹽水稀釋,1000×g離心5min,取上清液于532nm處測定A532nm,用標準品曲線計算MDA含量。1.9角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠血清中一氧化氮(nitricoxide,NO)含量的測定將對氨基苯磺酰胺溶于5%的磷酸中,配制成濃度為1%的對氨基苯磺酰胺溶液100ml,另配置0.1%的鹽酸萘乙二胺水溶液100ml,將上述2種溶液等體積混合后即為Griess試劑,4℃保存。取1.4處理小鼠,每組10只,眼眶采血,離心,分離血清100μl,加入等體積Griess試劑,室溫反應10min,于波長550nm處測定吸光度(A550nm)值,以A550nm表示NO含量。1.10角叉菜膠致小鼠足跖腫脹小鼠致炎足組織中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量的測定取1.5處理小鼠,每組10只,剪下致炎后足,稱重,剪碎后分別浸泡于4.0ml酸化正丁醇中4h,超聲處理20min,棄足離心,取上清液2.5ml,加入正庚烷3ml和0.1mol·L-1的鹽酸1.2ml振蕩5min,離心棄去有機相,取水相0.5ml,加入0.1ml0.5%半胱氨酸、0.04%鄰苯二甲醛3ml和0.02%NaIO40.1ml后沸水浴10min,用熒光分光光度計在激發波長365nm,熒光波長480nm處,測定熒光強度(intenseoffluorescence,IF),表示5-HT的含量。2結果2.1對二甲苯所致的耳郭水腫的影響由表1結果可見,與模型組比較,AEE0.18和0.36g·kg-1均能顯著抑制二甲苯所致的耳郭腫脹(P<0.05,P<0.01),其抑制作用與阿司匹林相當,但強于丁香酚。2.2aee對小鼠臟器結構的影響表2結果顯示,與模型組比較,各給藥組伊文思藍的滲出均明顯減少,表明AEE0.18和0.36g·kg-1能顯著降低腹腔毛細血管通透性(P<0.05,P<0.01),與阿司匹林效果相當,丁香酚作用不顯著。2.3阿司匹林丁香酚酯對大鼠棉球腫脹的影響表3結果表明,與模型組比較,AEE0.18和0.36g·kg-1均能抑制棉球肉芽組織增生,與阿司匹林和丁香酚作用相似。2.4小鼠急性足跖水腫與模型組比較,AEE0.18g·kg-1組與阿司匹林均能顯著抑制角叉菜膠所致的小鼠急性足跖腫脹(P<0.05,P<0.01);丁香酚抑制作用不明顯(表4)。2.5aee對炎癥組織及血清中相關指標的影響表5結果表明,與模型組比較,AEE0.18和0.36g·kg-1可明顯減少炎癥組織中PGE2含量(P<0.05,P<0.01),作用與阿司匹林和丁香酚相當。AEE0.18g·kg-1可減少炎癥組織中5-HT含量,與阿司匹林和丁香酚作用相似。AEE0.18和0.36g·kg-1對炎癥組織中MDA含量無明顯影響,阿司匹林和丁香酚可明顯降低炎癥組織中MDA含量(P<0.05,P<0.01)。AEE0.36g·kg-1可減少角叉菜膠致足跖腫脹小鼠血清中NO含量(P<0.05),與阿司匹林作用相似;AEE0.18g·kg-1和丁香酚對血清中NO含量無明顯影響。3從足跖水腫模型及抗炎藥物的抗炎作用炎癥是具有血管系統的活體組織對局部損傷的反應,可概括分為早、中、晚三期,早期主要表現為毛細血管擴張、通透性亢進、滲出和水腫;中期主要是白細胞向炎灶聚集;晚期則以炎灶屏障形成和組織增生為特點。本實驗采用各種急性和慢性炎癥模型觀察AEE的抗炎作用,二甲苯涂于小鼠耳部,使局部組織損傷,引起局部毛細血管通透性增加,某些炎癥介質如組胺、蛋白溶解酶釋放,導致滲出性炎性水腫;染料依文思藍與血漿蛋白結合,當致炎因子誘導毛細血管通透性增高時,在一定范圍內染料的滲出量可反映毛細血管滲出的血漿蛋白量;注射角叉菜膠誘發小鼠足跖腫脹模型是模擬炎癥腫脹的病理變化,這種方法也是目前常用的炎癥水腫模型,其特點是致炎局部白細胞浸潤,PGE2合成增加以及補體系統的激活,初期的水腫(致炎后lh內)主要由組胺和5-HT釋放所致,致炎后3h時水腫主要由PGE2介導,兩期之間的水腫主要是由激肽類物質維持;作為篩選抑制炎癥增殖期藥物的模型,棉球肉芽腫實驗屬于增生性炎癥實驗,棉球埋入小鼠局部皮下后可產生與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽增生,棉球誘導的小鼠肉芽腫模型造成的病理變化符合慢性炎癥模型。本研究結果顯示,AEE可以明顯抑制急性期毛細血管擴張及滲出、炎癥中期炎性水腫、慢性肉芽腫,表明AEE具有明顯的抗炎作用,與前體藥阿司匹林和丁香酚的抗炎作用相當。本研究結果表明,AEE與阿司匹林和丁香酚相似,可抑制環氧酶途徑的某個環節,減少炎性介質PGE2含量,同時亦可減少5-HT的含量;但AEE對炎癥組織中MDA含量無影響,