新月葉片組織培養的影響因素

月月也是著名的春、瘦客、春花、四季紅和月月紅。它來自中國，是薔薇科和薔薇科的植物。月季為半常綠灌木,花朵俏麗,色彩豐富,被譽為“花中皇后”。月季花能吸收硫化氫、氟化氫、苯、苯酚等有害氣體,同時對二氧化硫、二氧化氮等有較強的抵抗能力,因此月季花是保護和美化人類生活環境的良好花木。目前我國月季有上千個品種,但由于其繁殖以扦插繁殖為主,繁殖速度慢,滿足不了生產發展的需要,而組織培養可在短期內獲得大量的優良種苗,為此,我們撰寫了這篇文章,期望能夠促進月季組培快繁的研究工作。影響月季葉片組織培養成功與否的因素很多,現總結如下。1材料因素的影響1.1選擇物種依據對愈傷組織的誘導大量試驗證實,組織培養中基因型的依賴性是一種普遍現象。由于基因型的影響,不同月季品種間的組織再生頻率不同。任桂芳、王建紅、馮慧等選取24個現代月季品種無菌苗的頂生3片葉接種于培養基上,15d時部分品種葉片葉柄砧處開始不規則膨大,20d時可見綠色芽點,40d后形成不定芽,50d時12個品種可見不定芽的分化,且不同品種間的分化率差異很大,為10.9%～46.5%,其余12個品種未見不定芽分化。冰山品種的再生頻率最高,為46.5%。林婭、鄭玉梅等研究發現,月季不同品種之間愈傷組織誘導率和誘導數量差異顯著。“薩曼莎”、“金斯萊克”、“休姆主教”、“寵愛小姐”、“藍絲帶”、“卓越”、“埃菲爾鐵塔”7個品種在適宜的培養基上愈傷組織誘導率都能夠達到100%;而“櫻桃白蘭地”和“綠野”的愈傷組織誘導率分別只有60%和50%。此外,愈傷組織誘導的數量也因品種不同而有很大差異,依次是“薩曼莎”、“休姆主教”、“埃菲爾鐵塔”愈傷組織直徑為3～4mm,“卓越”2～3mm,“金斯萊克”、“寵愛小姐”、“藍絲帶”1～2mm,“櫻桃白蘭地”、“綠野”4～7個愈傷粒,愈傷粒直徑1～2mm。Hsia等報道不同品種、不同外植體在不同NAA濃度上產生不同的效果,‘BabyKatie’的葉片愈傷組織在11,27μmol/LNAA濃度下愈傷組織發生率高,并有根形成,在54,81μmo1/L有3%再生率。“RedSunblaze”葉片愈傷組織在11μmo1/L可達到6.6%的再生率。1.2影響生理狀態的影響1.2.1培養材料的選擇Chritel等以蘋果葉片為試材的比較試驗發現,不同來源的蘋果葉片其再生能力從大到小的順序為:試管苗、溫室苗、根蘗苗。月季上,朱鹿鳴等對50多個名貴月季品種進行了試管繁殖試驗。在幾種基本培養基(MS、Wpm、B5等)上均可成功。但以MS較好。不同品種月季在同一分化培養基上,其繁殖系數有較大差異。用液體培養基培養月季小芽其增殖速度比固體快,且小苗生長粗壯,但其培養方法有待進一步完善。誘導根原基的培養基為MS+NAA0.5mg/L或MS+IBA1.0mg/L。具有根原基的試管苗移栽成活率高,移栽速度快,可脫離培養基遠距離運輸,故用具有根原基試管苗比用根系已長出的試管苗有較大的優越性。1.2.2愈傷組織的觀察高莉萍、包滿珠用小葉和復葉柄作外植體在誘導培養基上黑暗培養8d后,切口處不同程度地膨大,以小葉外植體膨大更為明顯,未見明顯的愈傷組織。小葉中幼嫩、體積大并具有較長小葉柄者,小葉柄基部膨大程度最高,肉眼可見白色突起,是已分化的不定芽。切口膨大并已形成白色突起的外植體轉入發枝培養基進行光下培養后,突起很快變綠,抽出葉片并發育成枝條小葉外植體和復葉柄外植體的再生存在顯著性差異,2次重復試驗共60片小葉和40個復葉柄,其中51.8%的小葉和10%的復葉柄再生不定芽,平均每個外植體分化1.3和1個不定芽。1.2.3葉片外植體再生任桂芳、王建紅、馮慧等將金秀娃、冰山和火球3個月季品種無菌苗的不同部位葉片(頂生3片葉、中部葉片和基部葉片)接種于培養基上。結果表明頂部葉片的分化率最高,中部葉片次之,下部老葉片未見分化。高莉萍、包滿珠做了2次重復共試驗了49個三位葉和46個五位葉,平均有30.7%的三位葉和53.9%五位葉再生不定芽,每小葉再生1～2個不定芽。雖然五位葉的再生率高于三位葉,但它們之間并沒有顯著性差異。而且他們發現葉位對再生的影響不大,只要是幼嫩的未展開的小葉都能有效再生植株。因此,采用小葉外植體進行遺傳轉化時,材料的選取不必受到葉片位置的限制,材料來源更加豐富。Dubois等報道的兩步直接再生不定芽的方法是目前所報道再生率最高,需時最短的再生方法。他們首先將采自田間未展開的幼嫩復葉消毒后切成帶柄的小葉,此小葉在誘導培養基(1/2MS+1.5mg/LTDZ(噻重氮苯基脲)+0.05mg/LNAA+100mg/LCH(水解酪蛋白)+10mg/LAgNO3)上黑暗下誘導8天,然后.轉入發枝培養基(MS+0.5mg/LBA+0.01mg/LNAA+0.1mg/LGA3)中不定芽長成植株。所試24個品種25天后不定芽的再生率為65%～100%(其中15個品種再生效果非常好,5種較好,4種中等)。再生率越高的品種,再生所需時間越短,不定芽生長越快,且再生芽數也越多,并且田間苗較組培苗的效果好。張常青、洪波、王海琴等在葉柄再生芽的誘導中發現,經一定黑暗條件的誘導培養和光周期再生培養,不定芽再生可以同時通過愈傷組織發生和器官直接發生得到。葉柄外植體在添加7μmol/LTDZ的誘導培養基中暗培養10d,再轉接到MS添加0.5mol/L6-BA的再生培養基中16h/8h光周期培養,可以獲得57.1%的芽再生率。2-ba和naa、2,4-d的ms培養基的使用效果劉軍、豐震、趙蘭勇等研究發現,添加了生長素2,4-D的培養基比只有6-BA和NAA兩種激素的組合的其葉片愈傷組織誘導率要高,并且愈傷組織也比后者的大。2,4-D與細胞分裂素6-BA共同作用的效果明顯好于單獨使用的效果。對于品種來說,金徽章的愈傷組織誘導率明顯高于婚禮白。Rout等以Landora材料,在添加6-BA和NAA,2,4-D的MS培養基上,外植體葉在接種的7～12d后,在近軸面的葉柄和中脈處產生愈傷,愈傷組織誘導頻率高達92%。Hsia和Korban及Li等將品種R.hybrida‘CarefreeBeauty’的葉和節間在含2,4-D,或NAA的培養基上誘導愈傷組織,結果愈傷組織上分化出不少不定根,此帶根愈傷組織在含TDZ和GA3的培養基上分化出不定芽,再生率最高可達到53%。3激素濃度對運用短工酶誘導愈傷組織的影響在植物組織培養中,外植體愈傷組織的形成與外源激素的作用密不可分,多種激素的綜合使用時,其組合比例、濃度是組培成功最基本的條件。劉軍、豐震、趙蘭勇等研究表明,生長素2,4-D和細胞分裂素混合使用要比其它組合效果更好。他們經過2個多月的培養,M4培養基(MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2mg/L+活性炭0.3g/L)上葉片愈傷組織生長正常,增殖快,呈黃綠色,該培養基是誘導葉片愈傷組織的最佳培養基。林婭、鄭玉梅等通過試驗得出結論:在愈傷組織誘導時,NAA是適宜的生長素;它與KT或ZT配合,能夠誘導出比較理想的愈傷組織。細胞分裂素BA、KT、ZT和生長素NAA、2,4-D6種激素中,KT或ZT與NAA組合能夠較好地誘導月季愈傷組織。試驗選擇了含有不同濃度KT和NAA以及ZT和NAA兩組培養基試驗不同激素濃度對月季愈傷組織誘導的影響,結果表明激素濃度主要影響愈傷組織的顏色和質地;一般生長素濃度越高,愈傷組織顏色偏向于黃色,質地也越松散;但是有些品種當生長素達到一定濃度時,會發生不定根;并且不同品種適宜的激素濃度不同。愈傷組織形成后在原培養基中繼續培養或轉接于含有不同濃度ZT和NAA以及含有TDZ、NAA和GA的兩組愈傷組織分化培養基中,結果表明,在愈傷組織分化過程中,生長素仍然是必要的;GA對愈傷組織增殖具有負作用。高莉萍、包滿珠研究發現適合田間苗葉片分化不定芽的培養基較適合組培苗葉片分化不定芽的培養基對薩蔓莎小葉外植體不定芽的誘導更為有效,前者小葉不定芽的最高誘導率為51.8%,平均誘導率為39.4%,而后者的分別為44.4%和24.1%。在發枝培養基中,當BA濃度為0.5mg/L或1.0mg/L時,生長素使用NAA比使用等濃度的IBA效果好。生長素濃度為0.01mg/L時,不定芽誘導率高于生長素濃度為0.05mg/L時的誘導率,生長素濃度升高,可促進愈傷組織生長,但不利于不定芽的分化。他們還發現各植物生長調節劑組合中,經誘導適合田間苗葉片分化的培養基黑暗誘導8d后轉入含0.5mg/LBA和0.01mg/LNAA的發枝培養基培養的方法更適合月季品種薩蔓莎小葉的直接再生,不定芽誘導率為51.8%,平均每葉再生1.4個不定芽。在其它激素組合中,平均每葉再生不定芽數為1.0～2.4。4活性培養基的添加水解乳蛋白是一種復合有機添加物,馬純艷、賈景明比較培養基的成分時發現,加了水解乳蛋白的培養基比沒有添加此物質的培養基,其外植體周邊變黑程度得以改善,保持活性時間后者的長,愈傷組織比較大,且誘導率也高于后者,所以,他們認為水解乳蛋白中可能有某種有機營養物質是玫瑰葉培養中必不可少的,為外植體生長提供足夠的必須的營養,使其保持旺盛的生命力。5葉片外植體的誘導、分離和再生林婭、鄭玉梅、劉青林研究發現,在暗培養條件下,“薩蔓莎”、“休姆主教”、“寵愛小姐”、“卓越”、“埃菲爾鐵塔”葉片外植體的愈傷組織誘導率、愈傷組織數量與在光培養條件下誘導的沒有差異。但是愈傷組織色澤較暗,沒有綠色成分,質地也更松散。愈傷組織在相同培養基上繼代暗培養。4周后,“薩蔓莎”愈傷組織在MS+KT0.5mg/L+NAA2.0mg/L培養基上分化出綠色芽體。高莉萍、包滿珠將小葉外植體在誘導培養基上進行暗培養,然后轉入發枝培養基。他們發現,黑暗培養8d對葉片不定芽的誘導最有效,再生率為33.3%,每葉再生的芽數為1.4。而且延長暗培養時間有利于小葉柄基部生長淡黃色愈傷,不利于不定芽的分化及發育,因而再生率下降。張常青、洪波、王海琴等在葉柄再生芽的誘導中發現,經一定黑暗條件的誘導培養和光周期再生培養,不定芽再生可以同時通過愈傷組織發生和器官直接發生得到。葉柄外植體在MS添加7μmol/LTDZ的誘導培養基中暗培養10d,再轉接到MS添加0.5mg/L6-BA的再生培養基中16h/8h光周期培養,可以獲得57.1%的芽再生率。任桂芳、王建紅、馮慧等分別取金秀娃、冰山和火球無菌苗的頂生3片葉分別接種于培養基上進行暗培養試驗。結果表明暗培養30d對月季葉片的分化最為有利,冰山暗培養30d后分化率比無暗培養提高了30.9%。6不同材料對褐化的影響在月季葉片愈傷組織誘導過程中,褐化的發生比較嚴重。為降低褐化率,劉軍、豐震、趙蘭勇等認為首先要選擇適宜的外植體。所選材料的年齡、取材部位、材料的大小及外植體受