免疫學技術有在食品安全

檢測中的應用抗原的準備抗體的制備常用的免疫學檢測技術第一節抗原的準備天然抗原的制備人工抗原的制備合成抗原抗原制備的主要技術途徑天然抗原——分離、純化半抗原——人工合成、載體聯接抗原肽——合成、基因工程制備天然抗原的制備顆粒抗原的制備可溶性抗原蛋白抗原多糖抗原

顆粒抗原的制備1、血紅細胞抗原的制備：動物的新鮮血液+抗凝劑

離心去上清

NS懸浮

離心洗滌三次（2000轉/分）

綿羊紅細胞的制備流程圖4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%搖動15-20min顆粒抗原的制備2、細菌抗原的制備細菌培養（37℃，24小時）殺菌（100℃，2小時）

NS稀釋

菌體抗原

細菌細胞抗原的制備流程圖液體培養或斜面培養37℃24h100℃水浴2～2.5h殺菌無活菌試驗NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原種類：蛋白質多糖和細菌毒素。細胞內存在的部位：胞外抗原和胞內抗原。胞外抗原:收集培養液或分泌物。胞內抗原:提取、分離和純化。可溶性抗原的分離純化胞內抗原的提取、分離和純化細胞的破碎分離純化

1.酶處理法2.凍融法3.超聲破碎法4.表面活性劑處理細胞的破碎1、酶處理法常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等

特點：①適用于多種微生物；②作用條件溫和；③內含物成分不易受到破壞；④細胞壁損壞的程度可以控制。2、凍融法原理：因突然冷凍，細胞內冰晶的形成及胞內外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。方法：將待破碎的細胞置冰箱內凍結，然后緩慢融化，如此反復兩次，大部分組織細胞及細胞內的顆粒可被融破。特點：適用于組織細胞，對微生物細胞作用較差。3、超聲破碎法原理：①利用超聲波的機械振動而使細胞破碎。②超聲波使用的頻率從1kHz～20kHz，③間歇進行，避免長期超聲產熱，導致抗原破壞。特點：①操作簡單，重復性較好，節省時間；②多用于微生物和組織細胞的破碎。4、表面活性劑處理法原理：在適當的溫度、pH及低離子強度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。常用的有：十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型)、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。應用：破碎細菌，且作用比較溫和。抗原的純化1.超速離心法2.選擇性沉淀法3.凝膠層析法4.離子交換層析法5.親合層析法1、超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內，達到彼此分離的目的。應用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質的分離，如IgM、載脂蛋白A、B等。2、選擇性沉淀法原理：根據蛋白質理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同），常用33～50％飽和度的硫酸胺。特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。3、凝膠層析法原理：凝膠具有三維空間多孔網狀結構的物質，經適當溶液平衡后，裝入層析柱。當含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時，由于分子大小的不同先后被洗脫出來，從而實現對不同分子大小的物質進行分離。常用的如：如葡聚糖凝膠填料（sephadex

柱）凝膠層析（分子篩）4、離子交換層析法原理：利用帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。各種蛋白質的等電點不同，所帶電荷不同，與纖維素結合的能力有差別。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。離子交換層析+++———————++++++++——+++——++5、親和層析法原理：依據抗原抗體的生物學活性進行分離和提純的技術。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質上，制成免疫吸附層析柱。當樣品流過此柱時，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗IgG)結合；當改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗脫下來，達到純化的目的。優點：提取純度高、抗原抗體不失活性。正常細胞＋標記細胞洗滴標記細胞被酶裂解加入特異性抗體其它蛋白洗滌流失SDS分離蛋白

親和層析法示意圖親和層析抗原的鑒定1.含量鑒定：凱氏定氮法

2.理化性質鑒定①凝膠層析技術測定②聚丙烯酰胺凝膠電泳③凝膠管狀電泳④超速離心3.純度鑒定

常用醋酸纖維膜電泳

4.免疫活性鑒定

常用雙向瓊脂擴散試驗半抗原免疫原的制備

1.半抗原：低分子量的化學物質。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質、核苷、某些藥物(包括抗生素）及其他化學物品等。2.載體：蛋白質類多肽聚合物大分子聚合物3.半抗原-載體連接方法半抗原

+載體抗體BT完全抗原BBBT載體類型1.蛋白質：

人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。2.多肽聚合物：

人工合成的，常見的有多聚賴氨酸，其分子量大（可達十幾萬到幾十萬)，這種多聚物和半抗原結合后，可刺激免疫動物產生高效價、高親和力的抗體。3.大聚合物：

羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，可與半抗原結合，加入弗氏完全佐劑亦可誘發動物產生抗體。

半抗原-載體連接方法1碳化二亞胺法：R-NH=CH-R’半抗原＋載體蛋白質攪拌1～2h室溫24h透析除去未反應的半抗原人工免疫原半抗原載體連接方法1混合混合戊二醛法:半抗原-NH2載體蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-載體蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的帶有兩個活性基團的雙功能聯接劑半抗原載體連接方法2

半抗原-載體連接方法3氯甲酸異丁脂法：半抗原-COOH載體蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-載體蛋白半抗原載體連接方法3簡便，用于類固醇抗原制備HO-CH2CH(CH3)2＋

半抗原-載體連接方法4琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備半抗原-CH2OHCH2-COCH2-CO帶羧基的半抗原琥珀酸衍生物半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH吡啶再經氯甲酸異丁脂法或碳化二亞胺法制備載體半抗原半抗原載體連接方法4

佐劑

概念：

能非特異地通過物理或化學方法與抗原結合從而增強其特異性免疫原性的物質。條件：①增加抗原的表面積；②改變抗原的活性基團構型；③佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間；④可直接或間接激活免疫活性細胞；⑤無毒性或無副作用。

（二）常用佐劑的種類和制備1.氫氧化鋁佐劑：5%硫酸鋁5%氫氧化鈉氫氧化鋁沉淀制成懸液即為佐劑強烈攪拌NS洗二次NS等體積抗原免疫接種常用佐劑的種類及制備

2.明礬佐劑10%硫酸鉀鋁氫氧化鈉校正pH值至6.5沉淀乳狀懸液*明礬佐劑抗原常用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽種和膿腫。NS攪拌NS洗二次離心抗原備用防腐劑作用大于不完全佐劑局部形成肉芽種和潰瘍不能用于人體弗氏完全佐劑

3.弗氏佐劑(Freundadjuvant)液體石蠟完全乳化備用＋高壓滅菌加熱抗原弗氏不完全佐劑卡介苗羊毛脂鑒定一滴乳劑乳劑不散浮于液面水中混合

①增強抗原對機體的免疫原性；②增強抗體的產生能力；③為制備出高效價的免疫血清；⑤在某種情況下，改變Ag免疫應答類型；⑥延長抗原在免疫動物的時間；⑧增強局部對變應原的超敏反情況。佐劑的作用人工抗原及基因工程抗原用化學合成法或基因重組法制備含有已知化學結構決定簇的抗原，稱之為人工抗原。它可包括人工結合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。人工合成抗原用化學方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽。應用這種人工合成多肽可作為抗原。只由一種氨基酸形成的聚合體稱為同聚多肽，如由左旋賴氨酸形成的同聚多肽。由二種或二種以上氨基酸形成的聚合多肽稱為共聚