常用心肌缺血模型的比較

目前，主要用于預防冠狀動脈粥樣硬化的實驗研究，采用lagolff外心肌缺血置換術模型、左冠狀動脈前降支結心肌缺血置換模型和異丙醇誘導心肌缺血模型。也有少量文獻報道采用垂體后葉素誘導心肌缺血模型。本文從模型制作的原理方法要點、發病機制、觀察指標及應用展望多個方面對常用的3種心肌缺血模型加以比較。1模型生產原則和方法的要點1.1合理控制血壓心臟自動物體摘取之后,用有一定壓力、溫度(37℃)并充氧的修正洛氏液經主動脈根部灌流。灌流壓力宜始終控制在100cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)。心臟活動可通過張力換能器或壓力換能器進行記錄。Halapas等采用心臟起搏器(Harvardpacemaker)將心率維持在320次/min控制灌流壓,關閉起搏器即造成全心缺血,打開即為再灌注。給灌流液后1min內心臟即開始恢復跳動,但心率較慢常有心律不齊,宜穩定10~20min,HR控制在200~300次/min為佳。灌流壓力和灌流液溫度要嚴格維持恒定。1.2左心肌梗死前充血該模型是通過開胸結扎冠脈左前降支造成左心室前壁供血中斷,建立急性心肌缺血梗死模型,停止結扎即為再灌注。Wen等麻醉大鼠,氣管插管后連接小型動物呼吸機機械通氣。距胸骨左緣2cm處行胸廓切開,剪斷第4、第5肋骨。微頭無創縫合針連接6/0絲線從左冠狀動脈前降支根部穿過將心臟輕輕放回胸腔恢復20min。經過上述操作過程,出現心律失常或血壓持續低于70mmHg(1mmHg=0.133kPa)的被排除。手術結扎缺血時間多為30min,再灌注時間依據實驗目的有2h、12h、24h、2d、7d、14d等。此法動物創傷大、死亡率高,要求術者技術嫻熟。在麻醉期間應給動物采取保溫措施。開胸時宜在短時間內調小潮氣量,避免手術器械或拉鉤損傷充氣的肺組織。1.3劑量和常用劑量ISO是一個強的β受體興奮劑,能通過加快心率、增強心肌收縮力等環節增加心肌耗氧量,造成心臟負荷過重,心肌微循環及代謝障礙。連續應用可形成心肌梗死樣變化。造模方法多采用ISO間隔24h皮下注射2次。ISO給藥量差異較大,劑量與死亡率不成比例關系。目前報道的最小劑量是Devika等用的0.5mg/kg。最大劑量為500mg/kg。此外5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、85mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg均為常用劑量。60mg/kg以下劑量多用來誘導急性心肌缺血及藥物對急性心肌缺血損傷的作用,大部分為可逆性損傷。85mg/kg及以上劑量多用來誘導心肌缺血致心肌梗死、壞死、纖維化及心肌重塑等方面的研究,損傷多為不可逆性。其中采用85mg/kg誘導心肌壞死模型的文獻報道最多。Panda等分別用65mg/kg、85mg/kg、120mg/kg和200mg/kg的ISO誘導大鼠心肌缺血壞死模型,發現85mg/kg劑量最為理想。各種酶類、炎癥遞質和過氧化指標改變最顯著,而心肌組織損傷程度為中等。2心肌缺血損傷形成機制的比較2.1tnf-和il-6對心血管疾病的作用Langendorff心肌缺血損傷以炎癥損傷機制為主。炎癥損傷因子有TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10等。在心肌缺血損傷中以TNF-α和IL-6的作用最明顯。TNF-α能刺激中性粒細胞向心肌細胞浸潤、聚集和釋放可溶性遞質。TNF-α還可刺激血管平滑肌產生一氧化氮合成酶,一氧化氮合成酶生成增多,肌動蛋白合成減少,使血管平滑肌細胞收縮較弱,加重心肌缺血。IL-6是冠心病的危險預測因子。無論是慢性心肌缺血還是急性冠脈綜合征,IL-6的水平都升高。Cha等采用Langendorff法制作全心缺血模型。發現TNF-α表達升高,心臟收縮功能明顯下降。2.2心肌梗死前體誘導表達手術結扎冠狀動脈左前降支法以炎癥損傷和細胞凋亡損傷為主。TNF-α、IL-1β、IL-6的水平受信號轉導通路調節。目前報道的炎癥損傷通路有TLR4通路、NF-kappaB通路、p38MAPK通路等。這些通路相互交織,形成復雜的網狀結構,其中TLR4通路在心肌缺血性損傷過程中起關鍵作用。Andrassy等采用冠狀動脈左前降支結扎法制作心肌缺血動物模型。發現壞死細胞和激活的免疫細胞能釋放一種核因子叫做高遷移率族1(HMGB1),HMGB1作為配體結合TLR4,誘導NFκB的激活和TNF-α、IL-1β的大量產生,加重心肌細胞損傷。楊簡等發現冠狀動脈左前降支結扎法心肌缺血損傷后1hTLR4mRNA表達至高峰;心肌組織TLR4mRNA表達水平與心肌組織TNF-α水平呈正相關。Bcl-2基因家族是調節凋亡的主要基因家族,其中Bax蛋白可通過孔道形成增加線粒體外膜通透性促進凋亡,而Bcl-2則可與Bax結合抑制其作用而緩解凋亡。Osipov等報道結扎冠狀動脈左前降支心肌缺血模型,凋亡前體蛋白PARP顯著升高,存活前體蛋白Bcl-2、p-PKC顯著下降,Bcl-2/Bax比值顯著降低,caspase-3mRNA表達也明顯增加。抑制心肌細胞凋亡能夠減少50%~70%的心肌缺血梗死面積。表明抑制細胞凋亡成為藥物治療的重要靶點。2.3iso和采用體外治療的心肌損傷的機制ISO皮下注射誘導法的心肌損傷機制以氧化應激和干擾線粒體能量代謝和呼吸鏈功能為主。脂質過氧化(MDA升高)、iNOS升高、氧自由基及過氧亞硝酸陰離子(ONOO-)大量產生是造成心肌組織氧化應激損傷的重要原因。在生理情況下,通過eNOS合成少量NO維持擴張冠脈血管,抑制血小板的黏附與聚集,防止血栓形成等生理功能。在創傷、缺血、缺氧等應激環境下,受炎癥因子刺激,iNOS表達增加,產生大量的ONOO-和氧自由基,ONOO-具有很強的氧化和硝基化作用,可以使細胞膜脂質過氧化、核酸硝基化、DNA斷裂,產生嚴重的細胞毒作用,導致心肌細胞凋亡、心室重塑或心肌功能障礙。Zhang等發現ISO誘導的心肌損傷嚴重程度與iNOS表達量呈正相關。Ribeiro等發現ISO誘導的缺血心肌組織iNOSmRNA表達明顯升高。線粒體基質內含有脂肪酸β氧化和三羧酸循環所需的全部酶類,內膜上具有呼吸鏈酶系及ATP酶復合體,是心肌能量代謝的主要來源。Yuan等采用ISO5mg/kg腹腔注射誘導大鼠急性心肌缺血,發現心肌線粒體脂肪酸β氧化限速酶:肌型肉堿轉移酶I(M-CPT-I)和關鍵酶:中鏈脂肪乙酰輔酶A脫氫酶(MCAD)mRNA表達均明顯下降,過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)mRNA表達也明顯下降。Devika等采用ISO100mg/kg間隔24h皮下注射兩次,發現心肌線粒體三羧酸循環酶:異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶活性顯著下降。呼吸鏈標志性酶:NADH脫氫酶和細胞色素c氧化酶活性顯著下降。Karthikeyan等采用ISO85mg/kg間隔24h皮下注射2次,結果心肌線粒體內細胞色素(b,c,c1,aa3)、磷脂和ATP顯著減少,而膽固醇、三酰甘油和游離脂肪酸卻顯著升高。Prabhu等采用ISO200mg/kg間隔24h皮下注射2次,結果發現心肌線粒體組織蛋白酶-D(cathepsin-D)和β葡萄糖醛酸酶(beta-glucuronidase)活性顯著降低,心肌線粒體膜穩定性下降。3心肌缺血損傷的監測指標3.1左心室收縮壓力該模型能獲得比較多的心功能、血流動力學方面的參數且能觀察藥物的即時效應。如:冠脈流量、心率(HR)、平均動脈壓(MAP)、左心室最大收縮/舒張速率(±dp/dtmax,mmHg/s)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室收縮壓力(LVSP)等。3.2血清和心肌生化指標該模型可監測造模過程中心電圖、血流動力學變化,可觀察造模后各時點的反應炎癥損傷和細胞凋亡等生化指標和病理變化。心肌缺血的Ⅱ導聯心電圖表現為:ST段向上偏移>0.1mV,T波高聳超過同導聯R波的1/2。血流動力學變化為:+dp/dtmax降低,-dp/dtmax延長,LVEDP升高。反應炎癥損傷的重要生化指標有血清和心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的水平,TLR4、NFkBp65mRNA及蛋白的表達水平。反應細胞凋亡程度的生化指標是Bcl2、Bax、Fas和FasL、caspase-3、caspase-9等。3.3iso誘導心肌組織模型該模型可監測造模后心電圖、血流動力學變化以及造模后各時點的氧化應激和干擾線粒體能量代謝的生化指標和病理變化。Wu等記錄Ⅱ導聯心電圖為ST段抬高>0.1mV,約在30s時,T波顯著高聳,ST段抬高,甚至出現單向曲線。反應心肌損傷程度的生化指標有:肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等。Karthikeyan等用ISO誘導心肌缺血模型,血清及心肌組織中AST、ALT、LDH、CK和CK-MB水平明顯升高,4h達高峰。心肌組織iNOSmRNA表達增高,SOD表達下降。病理觀察方面:電鏡下可見心肌細胞部分肌絲斷裂、缺失,肌節攣縮,線粒體腫脹,肌漿網擴張,心肌細胞中凋亡小體顯著增多。Nivethetha等用ISO誘導心肌缺血模型,心肌組織病理變化表現為心肌細胞排列稀疏,心肌纖維腫脹、斷裂、橫紋肌消失;核固縮、破碎甚至消失,間質水腫明顯,血管擴張及炎細胞浸潤,有灶性出血,甚至有大面積肌溶現象。Mikaelian等發現ISO注射第7天梗死區有膠原纖維沉積,第14天瘢痕形成。注射ISO后的病理變化規律為注射后2h心尖及心內膜即出現變性和水腫,局限于心內膜下的散在點狀壞死;注射后4h出現小壞死灶,在心尖、心內膜及血管周圍處可見有結構的肌原纖維斷裂,并有炎性細胞浸潤,形成凝固性肌溶解;注射后1周,可見界限清晰、多發性散在壞死灶,灶內有炎細胞浸潤,有膠原沉積和成纖維細胞增生;注射后2~3周壞死病灶面積達到最大,病灶內出現大量的纖維化。4心肌缺血模型Langendorff法為全心缺血模型,利用該模型獲得大量的心功能和血流動力學方面的參數。另外,排除了活體神經內分泌因素對心臟的影響,藥效易于觀察,且給藥靈活方便也是該模型的優點。手術結扎冠狀動脈左前降支的方法,可造成單純左心室前壁缺血梗死。此造模方法可研究再灌注損傷,也可以讓動物存活,觀察藥物遠期療效及動態觀察缺血再灌注損傷后的發生發展和轉歸。如Ambler等結扎冠狀動脈左前降支30min再灌注2h后連續給硫醇類抗氧化劑4周觀察藥物對心室重構的影響。該方法的模型既可用于病因病機的研究,也可用于藥理藥效學的觀察。ISO誘導心肌缺血模型的優點是省時、省力、簡單易行,不需要特殊設備,多用于藥理、藥效學的研究,既可預防給藥亦可治療給藥。尤其是在研究缺血梗死后的心室重構和心肌纖維化方面有顯著優勢。Langendorff體外灌注法今后會更多的用來觀心肌電生理、冠脈流量、炎癥損傷和細胞凋亡等方面的指標改變。手術結扎冠狀動脈左前降支法主要會觀察心肌