#/6最新資料推薦寡核苷酸的純化與質量鑒定寡核苷酸的純化與質量鑒定市售或者委托別人合成的寡核苷酸常常已經純化，自行合成的須經過純化后方可應用。一、寡核苷酸的收獲和去保護基結合在合成柱內玻璃粉上的寡核苷酸鏈經濃氨水處理后便脫落下來，核苷酸鏈上的保護基因在濃氨水中于55°C水浴中保溫6小時以上被去除，經Sephadex-G25柱脫鹽干燥后分裝保存。（一）將合成柱一頭的圭寸蓋打開，將顆粒倒入一個3.0ml帶有密封墊的螺口蓋小瓶內，加入新開封的濃氨水2ml。密封好，置55C水浴過夜（至少6小時）。這步操作將脫支持物與去保護基兩步合并到一起，目的是為了減少脫支持物不徹底造成的寡核苷酸的丟失。合成柱不易拆開的，可在合成柱一端接上5ml一次性注射器，分兩次加入以上量的濃氨水，使氨水充滿合成柱并設法使之停留在柱內，留置15分鐘后將氨水推入小瓶內，再向柱內注入第二次氨水，作用15分鐘后推出。同法進行55C過夜處理。用注射器注入氨水需注意盡量密封，以免氨氣揮發，可將注射器的活塞插入針管內，推入的距離不要太大，以免壓力過大使氨水從柱的另一端流出。（二）從55C水浴中取出小瓶后不能立即開蓋以免液體因氨氣的逸出而飛濺，需將小瓶置4°C冷卻，以降低瓶內氨氣產生的壓力。（三）準備Sephadex-G25柱。稱取10gSephadexG25，灑在200ml去離子水中，待浸透后置100C水浴中煮沸1小時。室溫下放置30分鐘，傾去上層不沉淀小顆粒。用一個10ml一次性注射器制作分離柱，柱下不接導管，裝Sephadex-G25至10ml刻度，在頂上放一圓形濾紙片，以防止加液時攪動柱床，用30ml1%氨水洗柱，讓液體自然流干。這樣的分離柱床外水約為3.5ml。準確的體積可用藍葡聚糖溶液測定。（四）將過夜處理的寡核苷酸濃氨水液加到Sephadex柱上，用0.5ml1%氨氣洗滌小瓶，待液體完全進柱后將其加入柱，然后用3.5ml1%氨水洗脫并立即收集此3.5ml流出液。若重復使用Sephadex柱，起碼要用30ml1%氨水洗脫，除去柱內的鹽份。（五）測OD260。取4l收集液用去離子水1ml稀釋后于260nm測0D值。（六）收集液適當分裝成數份（如每份5OD），于-20C凍結，在離心真空濃縮器中干燥。（七）離心真空干燥，然后用去離子水（0.4ml）溶解干粉，再真空干燥一次，將寡核苷酸溶解適當濃度備用。根據1OD=40g寡核苷酸計算產量。為了不浪費寡核苷酸，測OD所用的稀釋液可以保留，可用來溶解寡核苷酸、進行5末端標記等。注意每次測定寡核苷酸濃度時應將比色杯清洗干凈，以免被其他DNA污染。干燥的寡核苷酸可在室溫下運輸，收藏最好于低溫。二、寡核苷酸質量鑒定寡核苷酸的質量需經電泳鑒定，確定產物的純度。取大約20ng寡核苷酸進行5末端標記，（操作見寡核苷酸探針標記部分）。用20%聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，用已知長度的標記寡核苷酸作長度對照，放射自顯影。如果寡核苷酸質量很好（小片段較少），用作PCR引物時可不必純化;用作ASO探針者，必須經過20%聚丙烯酰胺序列膠分離純化。三、聚丙烯酰胺變性膠分析和純化寡核苷酸（一）配制20%丙烯酰胺變性膠工作液（含19%丙烯酰胺、1%N，N-甲撐雙丙烯酰胺、1TBE、7mol/L尿素）（二）裝配聚丙烯酰胺凝膠模板，根據膠的厚度計算所用膠量，制備聚丙烯酰胺凝膠，分析膠膠厚0.4mm，制備膠厚1.5mm。（三）電泳及檢測1.分析膠：將標記好的寡核苷酸在80°C加熱5分鐘，加1/10體積的加樣液（0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯藍、94%甲酰胺）。電泳緩沖液用1TBE,上樣前預電泳30分鐘。1200V電泳，當溴酚藍進膠30cm時停止電泳（約4小時）。取下一面玻板，用保鮮膜覆蓋膠面。在暗室中放一張X光片在樣品部位，曝光1~2分鐘。用記號筆作好位置標記以便定位，沖洗X光片。可用已知長度的寡核苷酸作大小標志，多個樣品一起分析時可以不用標志。二甲苯藍的位置相當于25個核苷酸。位置正確的寡核苷酸帶可挖出作探針。純化制備膠：膠厚度一般為1.5mm，上樣量為2?30D/cm齒寬。將寡核苷酸溶在98%去離子甲酰胺中，濃度為1OD/1，直接加樣,不要加染料，否則會干擾觀察DNA條帶。可在外側兩邊的樣品孔中加染料作為電泳進程的指示。當溴酚藍進膠20cm時停止電泳，需要5?6小時。由于膠比較厚，電泳中產熱多，電壓不能過高，一般為15?20V/cm，以免玻板破裂，如果有恒溫循環水裝置，電壓不受限制。將一側的玻板去掉覆蓋一層保鮮膜，翻轉玻板使膠在玻板的下方，輕輕去掉玻板，再覆上一層保鮮膜。在膠下方放一塊在紫外線激發下能發熒光薄層層析板（TLC），用短波紫外線燈照射。由于DNA吸收紫外線，在DNA區帶處TLC板不發熒光而呈黑色條帶，用清潔刀片切下所要的條帶。（四）從制備膠中回收寡核苷酸將膠塊放在離心管中搗磨碎，加入5mlTE、0.5ml酚，37°C搖混過夜。離心分離收集上清。再用5mlTE抽提膠末3小時。將兩次洗脫液合并，用正丁醇濃縮液體至體積lt;2.5ml。乙醚抽提3次除去正丁醇。過SephadexG-50柱、真空干燥。也可乙醇沉淀法。大頭醫生/免責聲明1.用戶明確同意其使用網絡服務所存在的風險將完全由其本人承擔；因其使用網絡服務而產生的一切后果也由其本人承擔。對用戶及任何第三方不承擔任何責任。2.不擔保或保證網絡服務一定能滿足用戶的要求，也不擔保網絡服務不會中斷，對網絡服務的及時性、安全性、準確性也都不作任何擔保或保證。不保證為向用戶提供便利而設置的外部鏈接的準確性和完整性，同時，對于該等外部鏈接指向的不由實際控制的任何網頁上的內容，也不承擔任何責任。對于因不可抗力或不能控制的原因造成的網絡服務中斷或其它缺陷，不承擔任何責任，但將盡力減少因此而給用戶造成的損失和影響。對于任何自本網站而獲得的他人的信息、內容或者廣告宣傳等任何資訊（以下統稱信息），不保證真實、準確和完整性。如果任何單位或者個人通過上述信息而進行任何行為，須自行甄別真偽和謹慎預防風險。否則，無論何種原因，本網站不對任何非與本網站直接發生的交易和/或行為承擔任何直接、間接、附帶或衍生的損失和責任。用戶同意，對于向用戶提供的下