第五節核酸的分子雜交

NucleicAcidHybridizationContentofTable

前言1核酸分子雜交技術的原理2核酸探針的制備3核酸探針的標記4核酸分子雜交技術5生物芯片技術

前言核酸分子雜交

把親源關系較近的，不同生物個體來源的變性DNA或RNA單鏈，經退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。Home1核酸分子雜交技術的原理有互補特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應同源區段將會退火形成雙鏈結構。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合適標記物（如放射性同位素、生物素等）予以標記，當作探針（probe),與變性后的單鏈基因組DNA或RNA進行雜交。再用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學等技術）把標記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列是否存在、拷貝數及表達豐度等。

應用：(1)檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數及表達豐度。Home2核酸探針的制備2.1探針（Probe)的概念:

一段帶有檢測標記的與目的基因或目的DNA特異互補的已知核苷酸序列。2.2探針的制備方法長度一般以50~300bp為宜。制備方法：

(1)DNA重組技術(2)PCR擴增(3)化學合成2.3探針的分類

據來源及性質不同可分為：

(1)基因組DNA探針(2)cDNA探針(3)RNA探針(4)寡核苷酸探針2.4合成寡核苷酸探針注意原則(1)長度（10-50bp);(2)G:C對含量40%-60%；(3)探針內避免互補；(4)避免同一堿基連續出現；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續8個以上堿基序列相同，最好不用。Home3核酸探針的標記為確定探針是否與相應基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號。3.1標記的種類同位素：32P、35S、3H、125I等標記探針非同位素：生物素、地高辛配體、熒光素等作為標記物

兩者比較：后者不及前者敏感，但后者保存時間較長，無同位素污染。一個理想的標記物應滿足：(1)標記前后探針基本結構、化學性質相同;(2)特異性強、本底低、重復性好；(3)操作簡單、節時；(4)安全、無環境污染。3.2探針的標記方法3.2.1缺口平移法3.2.2隨機引物標記法3.2.3末端標記法3.2.4生物素光照標記法Home缺口平移法的原理將DNAaseI的水解活性與大腸桿菌DNApolymeraseI的5`→3`的聚合酶活性和5`→3`的外切酶活性相結合。首先用E.coli的DNAseI在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去帶有5`-磷酸的核苷酸；同時利用該酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素標記的互補核苷酸補入缺口。

這兩種活性同時作用，缺口不斷向3`方向移動，DNA鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記DNA探針。

隨機引物標記法原理用一些六核苷酸作為隨機引物，將這些引物和探針DNA片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈DNA互補結合，再在DNA聚合酶的作用下，按堿基互補配對原則不斷在其3`-OH端添加標記的單核苷酸修補缺口，合成新的標記的探針片段。末端標記法原理（1）一種是在5`末端加成標記法：先用堿性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化標記的ATP的γ-磷酸轉移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探針3`-末端用末端轉移酶摻入一個單標記的[α-32P]dNTP。生物素光照標記法光敏生物素在紫外線照射下與DNA或RNA的堿基發生化學加成反應，獲得生物素標記的DNA探針。4核酸分子雜交技術此技術由Southern1975年首先設計。被檢測對象為DNA。4.1Southern印跡雜交帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術流程白瓷盤玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉膜。真空轉膜槽濾紙尼龍膜凝膠蓋子+-真空轉膜4.2Northern印跡雜交

與Southern雜交類似。檢測目的RNA的存在與否及含量。4.3Western印跡雜交將待檢測蛋白質（或酶）經PAGE電泳并染色后，轉移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應或“DNA-protein”結合反應鑒別濾膜上的蛋白質。4.4斑點印跡雜交和狹線印