第四講端粒與端粒酶

生命科學與生物制藥學院沈晗線性DNA復制過程中會出現一個問題，復制結束時，隨從鏈的5’末端的RNA引物會被細胞中的RNA酶所降解，因為缺乏3’-OH，缺口不能被補上，所以每復制一輪，RNA引物降解后新生成的5’末端都將縮短一個RNA引物的長度，盡管這個引物不長，但是細胞千千萬萬代地不斷復制，如果不進行補償，染色體不斷縮短，最終就會消失！1972年，JamesWatson首先提出了染色體復制的末端隱縮問題

一、端粒概念的提出1939年，BarbaraMcClintock（因為發現玉米的轉座子獲得諾貝爾獎）發現玉米細胞的染色體斷裂末端容易融合，而正常染色體的自然末端，為什么不容易相互融合呢？合理的推測是，染色體的自然末端不同于非正常的DNA斷裂末端，它應該有一個特殊的結構來避免染色體之間的相互融合。在逐漸明晰了染色體末端特殊結構的概念之后，人們給了它一個專有名稱-端粒（telomere）。二、端粒的基本性質三、端粒的基本功能四、端粒的研究歷史2009年10月5日，伊麗莎白?布萊克本、卡蘿爾?格雷德和杰克?紹斯塔克三位美國科學家一起獲得了今年的諾貝爾生理學或醫學獎。關于他們獲獎的原因，頒獎詞中這樣描述：“他們解決了生物學的一個重大問題：在細胞分裂時，染色體如何完整地自我復制以及染色體如何受到保護以免于退化。這三位諾貝爾獎獲得者已經向我們展示，解決辦法存在于染色體末端――端粒，以及形成端粒的酶――端粒酶。”這是百年來諾貝爾獎第一次同時頒發給兩位女性科學家，他們3人將分享1000萬瑞典克朗（約合966．7萬元人民幣）獎金。三位獲獎科學家3位獲獎者中，布萊克本最具名望，2007年曾入選《時代》百大最具影響力人物。其余兩位得主都是自她的研究得到啟發，并與她合作取得成果。除了科研了得，她的敢言作風亦為人稱道，她曾獲美國前總統小布什委任入生物倫理委員會，但她在布什禁止干細胞研究后，公開批評他以意識形態干預科學研究，2004年被辭退。布萊克本出生于澳大利亞，來自一個醫生世家，家人期望她從醫，但她卻決意要走科研之路。1971年，她在英國劍橋大學攻讀博士學位，師從諾貝爾得主桑格（Fred

Sanger）。1975年獲得博士學位后，她轉到耶魯大學，開始研究端粒。1978年在加利福尼亞大學伯克利分校建立實驗室，經過不懈努力，終取得重大發現。布萊克本發現端粒序列所用到的簡單模式生物四膜蟲四膜蟲的小染色體眾多，也就說端?？赡芊浅ＸS富。這就為端粒研究提供了得天獨厚的材料。1978年，布萊克本通過體外合成參入dNTP的實驗，利用四膜蟲的染色體發現端粒的秘密。推斷四膜蟲的端粒是由許多重復的5‘-CCCCAA-3’六個堿基序列組成的。1980年，在一次科學會議上，布萊克本為這個看似無趣的秘密找到了用武之地。這要感謝聽她報告的紹斯塔克。當時紹斯塔克正打算給酵母細胞人工合成一條DNA。但是，光禿禿DNA的容易給酵母細胞中的核酸酶吃掉。布萊克本和紹斯塔克一拍即合，決定給DNA片段末端加上這些CCCCAA堿基序列結果讓人大吃一驚——人工DNA能夠穩定的存在于酵母細胞內。1984年，布萊克本的實驗室發現酵母的端粒序列是由不太規則的TG1-3/C1-3A重復序列組成的。形象地說，線性DNA就像一條鞋帶，端粒就像兩頭的塑膠套，沒有塑膠套的保護，鞋帶很容易劈叉，磨損，直至散架1984年，格雷德作為博士生加盟了布萊克本的實驗室。在搗碎無數的四膜蟲之后，他們終于成功的分離了端粒酶。這個端粒酶的名字有點與眾不同。我們一般在給酶命名時，都以它的作用對象命名。比如，分解淀粉的叫做淀粉酶，分解蛋白質的叫做蛋白酶。而端粒酶剛好相反，它是以產物命名。更有意思的是，它合成端粒的DNA片斷是自帶的。也就是說，端粒酶相當于一個小作坊，自己為合成端粒DNA提供復制所需的原材料，完成添加端粒所需的重任。端粒和端粒酶發現大事記1939年，BarbaraMcClintock發現玉米細胞的染色體斷裂末端容易融合

1972年，JamesWatson提出染色體復制的末端隱縮問題

1978年，報道四膜蟲的端粒序列

1982年，端粒的發現導致人工染色體的發明

1984年，報道酵母的端粒序列

1985年，報道四膜蟲的端粒酶活性

1989年，報道四膜蟲端粒酶的RNA亞基

1994年，報道酵母端粒酶的RNA亞基

1995年，報道酵母端粒酶活性

1996年，純化了四膜蟲端粒酶的催化亞基,遺傳篩選到酵母端粒酶的催化亞基

1997年，證明了四膜蟲和酵母端粒酶的催化亞基端粒和端粒酶的一系列發現完美地解釋了這兩個問題：染色體末端的DNA由簡單重復的端粒序列構成，端粒（保護著染色體末端，使之區別于一般的斷裂染色體末端，而不被各種酶降解，相互之間不會融合。端粒酶負責端粒的復制，端粒酶的催化亞基利用端粒酶自己的RNA亞基作為模板通過轉位不斷重復復制出端粒DNA，從而補償在染色體復制過程中的末端隱縮，保證染色體的完全復制五、端粒及端粒酶的結構特點（一）端粒的結構及組成端粒：是真核細胞線性染色體末端特殊結構。由端粒DNA和端粒相關蛋白組成。

端粒DNA：為不含功能基因的簡單、高度重復序列,在生物進化過程中具有高度保守性。不同物種的端粒DNA序列存在差異。

端粒DNA由兩條互相配對的DNA單鏈組成,其雙鏈部分通過與端粒結合蛋白質TRF1和TRF2結合共同組成t環(tloops)。這種t環特殊結構可維持染色體末端的穩定,保持染色體及其內部基因的完整性,從而使遺傳物質得以完整復制。

電鏡下的端粒T環結構大多數有機體的端粒DNA由非常短而且數目精確的串聯重復DNA排列而成，富含鳥嘌呤，人類及其它脊椎動物染色體端粒的結構是5′TTAGGG3′的重復序列,長約15kb。體細胞的端粒有限長度大多數明顯短于生殖細胞，青年人的TRFs又顯著長于年長者，提示TRFs隨著細胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成復制成線性DNA末端所致。真核細胞染色體末端會隨著細胞分裂而縮短，這個縮短的端粒再傳給子細胞后，隨細胞的再次分裂進一步縮短。隨著每次細胞分裂，染色體末端逐漸縮短，直至細胞衰老。人類體細胞遵循這個規則從細胞出生到衰老，單細胞生物遵循這個規則分裂后定有其它機制保持單細胞生物傳代存活，生殖細胞亦如此。

熒光原位雜交顯示端粒和端粒DNA序列端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含G鏈)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(富含C鏈)

（二）端粒酶的結構

端粒酶在結構上為一核糖核蛋白復合體,由RNA和結合的蛋白質組成,是RNA依賴的DNA聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過明顯的模板依賴方式每次添加一個核苷酸。

端粒酶實質上是一種特殊的逆轉錄酶

端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉錄酶（TERT）端粒酶結合蛋白（TEP）

端粒酶示意圖端粒酶活性取決于它的RNA和蛋白質亞基.端粒酶至少包含兩個活性位點.端粒酶除了具有反轉錄活性外，還具有核酸內切酶的活性。另外一個重要的功能就是合成串聯重復的TTAGGG序列，為TRF2提供結合位點，防止染色體的末端融合。端粒酶的RNA亞基是合成端粒DNA的模板，對于端粒酶的結構和催化活性都十分重要.人端粒酶RNA有455個核苷酸.端粒酶RNA重要序列缺乏保守性，但都有保守的二級結構，端粒酶的RNA決定了端粒DNA的序列。

1、端粒酶RNA

哺乳動物端粒酶RNAs在許多組織的不同發育階段,甚至那些沒有端粒酶活性的組織中廣泛表達。體內端粒酶RNA的存在對端粒酶功能至關重要，影響到端粒酶RNA的穩定性與突變,也可改變體內端粒長度，并可通過改變端粒完整性或端粒結合因子的末端結合位點致細胞核分裂后期細胞死亡。2、端粒酶逆轉錄酶(Telomerasereversetranscriptase,TERT)

幾乎所有存在端粒酶的機體均含有一單獨的TERT基因,哺乳動物TERT的轉錄由許多轉錄因子、激素和細胞外信號嚴格控制。不同的轉錄因子調節hTERT在不同的細胞內含物中的表達。癌基因c-myc是一個受特殊信號調節的可誘導癌基因,并可與H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT等癌基因協同作用,促進細胞無限增殖,獲得永生化并發生癌變。

3、端粒酶相關蛋白(TEP)

⑴端粒酶相關蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA結合蛋白，對端粒酶活性起調節作用⑵生存動力神經細胞基因(SMN)產物熱休克蛋白（hsp）90、其他涉及到TERT轉錄后修飾的蛋白包括磷酸酶-A、Akt、cAbl、p53和PARP。PinX1與人TERT體外共表達時抑制人端粒酶活性。⑶芽殖酵母蛋白Est1p和Est3p這兩個蛋白與體內端粒酶的功能有關。Est1p足以使端粒延長。但是,在無Est1p存在的情況下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以維持端粒長度。2008年美國科學家利用X射線結晶學方法，揭示了端粒酶（Telomerase）關鍵部位的三維結構圖端粒酶結構示意圖。蛋白質（綠色）與RNA（淺褐色）及DNA（紫色）聯合在一起。四膜蟲端粒酶對端粒DNA的復制模式圖端粒酶的爬行模型（動畫演示）

端粒酶的功能

端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的酶，它可以維持端粒的長度，維持細胞增殖潛能。端粒酶以自身RNA為模板合成端粒酶重復序列，具有逆轉錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達能穩定端粒的長度，抑制細胞的衰老，在生殖細胞和干細胞中可檢測到高水平的端粒酶活性。在體內還不清楚每一次細胞分裂有多少端粒DNA合成。體內端粒酶的延長功能是一復雜的動態過程:受雙鏈端粒結合蛋白包括RAP1(芽殖酵母)、存在于t環的TRF1(依賴于端粒酶)和TRF2(不依賴于端粒酶)的負調控。

六、端粒－端粒酶對與腫瘤的發生

“端粒－端粒酶假說”認為端粒酶的激活與細胞永生化和惡性腫瘤的發生、發展密切相關。染色體末端的端粒DNA進行性的縮短是限制人細胞壽命的先決條件。相對地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被認為是細胞永生化和癌癥發展必需的一步。目前的資料證實,端粒酶對長期成活的組織和長期進行有絲分裂的細胞是必需的。

端粒酶被抑制正常人體細胞端粒丟失

M1期阻滯SV40T抗原細胞分裂停止Rb、P53與病毒蛋白結合、突變

↓M1—M2期間隔永生化雙著絲粒形成

↓

M2期退化染色體失穩端粒酶被激活

細胞凋亡

端粒酶在人體細胞永生性轉化中端粒變化與腫瘤發生

盡管有研究認為端粒長度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即端粒替代延長（altematireLengtheningoftelomereALT）機制，但其存在上并不能否認永生化細胞中端粒酶的重要作用。自從1994年Kim等創立TRAP法檢測端粒酶活性以來，越來越多的文獻證明端粒酶活性在大多數人類原發性腫瘤標本及腫瘤衍生細胞系中可被檢測到。美國學者在400多例來源于12種不同組織的原發腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽性率高達84.8％，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為4.4％。

附表人體組織中端粒酶活性腫瘤部位/類型與腫瘤鄰近正常組織/良性病變腫瘤組織（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）結腸0/45（0）22/23（95.6%）肝——1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）腎0/55（0）40/55（72.7%）神經母細胞瘤0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLLALL）——21/23（91.3%）腦——6/8（75%）其它（頭頂部，Wilms瘤）8/93（8.6%）24/26(92.3)合計14/332（4.2