PRRS實驗室診斷監測技術

-----RT-PCR檢測技術

黑龍江省動物衛生監督所主要內容PCR技術PRRSVRT-PCR

檢測技術動物病毒的組成兩部分1.蛋白質：HA、HI、ELISA2.核酸：分為兩種脫氧核糖核酸（DNA）---PCR核糖核酸（RNA）---RT-PCR

PRRS病毒粒子的結構PCR技術概念

PCR是一種在體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術，它以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物介導，通過DNA聚合酶酶促反應，快速體外擴增特異DNA序列。

PCR技術簡史1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段

所以，Khorana的設想被人們遺忘了……PCR的最初設想PCR的實現PCR的改進與完善PCR技術簡史PCR的最初設想PCR的實現PCR的改進與完善1985年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等人發明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用大腸桿菌DNA聚合酶進行PCR，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。PCR技術簡史1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。

PCR的最初設想PCR的實現PCR的改進與完善基本原理適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環,每一次循環使特異區段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經過30次循環,最終使基因放大了數百萬倍;擴增了特異區段的DNA帶。1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR反應條件1）PCR反應成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶，特別是染色體中的組蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導致模板與引物錯配,反應非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量過高可引起反應非特異性擴增;酶量過少則合成產物量減少。（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等，如果有一種濃度不同于其他幾種，就會引起錯配。濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高反應特異性降低，出現非特異擴增。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。2）循環參數變性一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。(2)退火退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

3）延伸PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

（4）循環次數主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加PCR的特點特異性強PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結合；

②堿基配對原則；

③TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個PFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的應用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，基因診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫犯罪現場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測PRRSVRT-PCR

檢測技術用途豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測試劑盒，用于檢測豬血清和組織中的PRRSV，適用于PRRSV的檢測、診斷和流行病學調查。原理利用離心柱內硅基質膜提取RNA，在反轉錄酶的作用下，以RNA