高效液相色譜法測定卡格列凈中葡萄糖酸-&內酯的含量董淑波;楊漢躍;嚴拯宇【摘要】AmethodfordeterminationofGlucono-S-Lactone(GDL)inCanagliflozinwasproposedbyHPLCcoupledwithchargedaerosoldetection(HPLC-CAD).Theoptimizedchromatographicconditionswereasfollows:?ThermoHypersilGoldAqcolumn(250mmx4.6mm,5pm)wasusedasstationaryphase;②themobilephasewasamixtureofacetonitrile-water(9+-1)solutionwithaflowrateof0.5mL?mini;③columntemperaturewas30°C;④theinjectionvolumewas10pL;@thenebulizationtemperatureofCADwassetat50C,andpressureofcarriergaswas427.5kPa.Underabovechromatographicconditions,linearityrangeforGDLinmassconcentrationfoundwas1.05-22.5mg?L-1,andthedetectionlimit(3S/N)foundwas0.32ng.Testforrecoverywasmadebystandardadditionmethodat3concentrationlevels,givingresultsintherangeof96.2%-103%.Thesamplesolutionandreferencesolutionwerestablefor12hatroomtemperature,andRSDs(n=7)foundwere1.8%and1.3%,respectively.%提出了高效液相色譜-電霧式檢測器法(HPLC-CAD)測定卡格列凈中葡萄糖酸-S-內酯(GDL)的含量.優化的色譜條件如下:ThermoHypersilGoldAq色譜柱(250mmx4.6mm,5pm),流動相為乙腈(9+1)混合溶液流量0.5mL?min-,柱溫30C,選樣量10pL;電霧式檢測器(CAD)的霧化溫度為50C,載氣壓力427.5kPa.在上述的色譜條件下,GDL的線性范圍為1.05-22.5mg?L-1,GDL的檢出限(3S/N)為0.32ng在3個濃度水平上進行加標回收試驗，測得回收率在96.2%-103%之間.供試品加標溶液和對照品溶液在室溫條件下放置12h內穩定,測定值的相對標準偏差（n=7）分別為1.8%,1.3%.【期刊名稱】《理化檢驗-化學分冊》【年（卷），期】2017（053）004【總頁數】6頁（P387-392）【關鍵詞】高效液相色譜法;電霧式檢測器;葡萄糖酸-S-內酯;卡格列凈【作者】董淑波;楊漢躍;嚴拯宇【作者單位】中國藥科大學理學院分析化學教研室，南京210000;江蘇德源藥業股份有限公司，連云港222000;中國藥科大學理學院分析化學教研室，南京210000【正文語種】中文【中圖分類】0652.63D-葡萄糖酸-S-內酯（簡稱葡萄糖酸內酯，GDL）作為凝固劑、酸化劑、改良劑等添加劑廣泛應用于食品領域［1-3］。近年來，GDL又被作為醫藥中間體廣泛應用于鈉-葡萄糖協同轉運體-2（SGLT-2）抑制劑的合成過程中，如強生制藥公司的Invokana?（卡格列凈，Canagliflozin）、阿斯利康和百時美施貴寶公司的Farxiga?（達格列凈，Dapagliflozin）以及勃林格殷格翰制藥公司和禮來公司的Jardiance?（恩格列凈，Empagliflozin）［46］。卡格列凈（CG）是FDA批準的首個SGLT-2抑制劑，用于治療成年患者的II型糖尿病。作為CG合成的中間體，GDL可能會隨著工藝殘留至產品中，ICHQ3A規定新原料藥中特定雜質的限度一般不得超過0.15%（質量分數）。為了保證CG臨床使用的安全性和有效性，針對GDL在CG原料藥中允許殘留的低限度水平，需要建立一種靈敏度高、選擇性好的GDL含量測定的方法。GDL及CG的結構式見圖1。由于GDL為弱紫外吸收化合物，無法用常規的紫外檢測器檢測。目前報道的測定GDL的方法主要有比色法［7］、酸堿滴定法［8］、紫外分光光度法［9-10］、氣相色譜法［11-12］、高效液相色譜示差折光檢測器法［13-15］和離子色譜脈沖安培檢測器法［16］等。比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、示差折光檢測器法的靈敏度較低，且重復性不好；酸堿滴定法專屬性較差，測定結果易受酸性物質的干擾；由于GDL對熱不穩定，1531左右即分解，因此采用氣相色譜法直接測定GDL容易產生降解影響分析結果，準確性低；也可將GDL使用甲基硅烷衍生化或者乙酰化后采用氣相色譜法分離測定，但此類方法前處理相對繁瑣;離子色譜脈沖安培檢測器無法直接檢測GDL,且儀器使用成本較高。此外，GDL為強極性化合物，其分離相對困難。目前，對GDL的分離主要采用氣相色譜法、離子色譜法和高效液相色譜法等。將GDL使用甲基硅烷衍生化或者乙酰化等柱前衍生化后采用氣相色譜法以中等毛細管柱分離測定，方法前處理相對繁瑣，且GDL保留時間較長。離子色譜法主要采用離子交換色譜柱分離GDL的降解產物葡萄糖酸，無法直接測定GDL的含量。目前應用最多的是高效液相色譜法，采用糖柱、有機酸柱、氨基柱或者C18柱分離待測物。強極性化合物在普通C18柱上幾乎不保留，測定時受溶劑或其他強極性物質的干擾較大；有機酸柱主要用于分離GDL的降解產物葡萄糖酸，且GDL與葡萄糖酸的分離效果并不理想；糖柱、氨基柱等柱流失嚴重，在使用過程中理論板數下降較快，使用壽命較短；雖然氨基柱改良為聚合型填充材料，但同規格的聚合型氨基柱與鍵合型氨基柱相比，柱效明顯下降。鑒于以上原因，開發一種操作簡便、靈敏度高、選擇性好的快速直接分離測定GDL含量的方法具有重要的意義。本工作采用高效液相色譜法測定卡格列凈中葡萄糖酸-S-內酯的含量，以極性包埋C18鍵合相的固定相為色譜柱（ThermoHypersilGoldAq,250mmx4.6mm,5pm），配合電霧式檢測器（CAD）對GDL進行分離和測定。1.1儀器與試劑ThermoUltiMate3000型高效液相色譜儀，配HPG3400SDN型泵（含內置脫氣機），WPS3000TSLANALYTICAL型自動進樣器，TCC3000RS型柱溫箱；DAD3000型二極管陣列檢測器；ThermoCoronaUltra型電霧式檢測器（CAD）；Chromeleon7.2SR4色譜數據工作站。GDL對照品儲備溶液：150mg?L-1，稱取GDL15.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL。GDL對照品溶液：15mg?L-1,移取GDL對照品儲備溶液1.00mL，用甲醇定容至10mL。D-葡萄糖酸-S-內酯（純度不小于99.9%）；乙腈、甲醇為色譜級；試驗用水為超純水。1.2儀器工作條件ThermoHypersilGoldAq色譜柱（250mmx4.6mm,5pm），流動相為乙月青（9+1）混合溶液，流量0.5mL?min-1，柱溫30°C,進樣量10"；CAD的霧化溫度50C，氮氣壓力427.5kPa。1.3試驗方法稱取CG試樣100.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成供試品溶液，按儀器工作條件進行測定。以15mg?L-1GDL溶液為對照品，夕卜標法定量。2.1檢測器的選擇通用型檢測器特別適用于無紫外吸收或弱紫外吸收化合物的檢測。CAD為一款通用型檢測器，其響應不依賴于化合物的結構，只要待測物不具有揮發性，在色譜柱中能被完全分離，都可以通過電霧式檢測器進行分析，并且CAD與蒸發光散射檢測器(ELSD)、示差折光檢測器(RI)等通用型檢測器相比，具備靈敏度高的特點［17-18］。GDL為弱紫外吸收化合物［9］，選用常規的紫外檢測器無法實現微量樣品的準確定量。試驗選擇CAD測定GDL的含量。2.2色譜柱的選擇氨基柱是分離糖類化合物較為常用的色譜柱［19-20］,試驗首先選擇氨基柱考察GDL和CG的分離情況，以含0.1%(體積分數，下同)甲酸的甲醇溶液為流動相，流量為1.0mL?min-1,比較了鍵合型氨基柱(UltimateXB-NH2,250mmx4.6mm,5pm)和聚合型氨基柱(ShodexAsahipakNH2P-5040E,250mmx4.6mm,5pm)對GDL和CG分離的影響，見圖2。由圖2可知：鍵合型氨基柱的柱效高，分離效果好，但基線噪聲較大；聚合型氨基柱柱效低，分離效果差，但基線噪聲較小。針對極性化合物的分離，親水作用色譜(HILIC)是分離強極性及親水性化合物的另一色譜模式［21］。此外，通過采用極性或者親水性的封端試劑對C8或C18表面裸露的硅羥基進行封端，這種改性方式與典型的反相色譜柱相比，增大了內表面的水浸潤性，且較低的鍵合密度也使得孔內疏水性相對減小，因而允許使用100%水相，增強極性化合物的保留［22-23］。基于不同基質色譜柱的選擇性不同，試驗考察了UltimateXB-NH2(250mmx4.6mm,5pm)、ShodexAsahipakNH2P-5040E(250mmx4.6mm,5pm)、WelchHILICAmide(150mmx4.6mm,3pm)和ThermoHypersilGoldAq(250mmx4.6mm,5pm)等4種不同填料固定相的色譜柱對極性化合物GDL與CG分離的影響，見圖3。由圖3可知：鍵合型氨基柱XB-NH2和HILICAmide色譜柱均能滿足分離要求，但鍵合型氨基柱由于柱流失較大，靈敏度較低；HILICAmide柱分離度較好，但CG裂分為2個色譜峰，且柱流失也較為嚴重，影響檢測的靈敏度［24-25］;GoldAq色譜柱適合分離強極性化合物，在此固定相上，GDL可以與CG實現基線分離。對于極性化合物來說，在典型的C8以及C18色譜柱上，即使有機相體積分數為5%也不能夠做到有效保留。為實現極性化合物的有效保留，進一步降低有機相含量至零，則會引起色譜柱多孔內表面以及固定鍵合相的去濕現象（固定相塌陷）。ThermoHypersilGoldAq色譜柱對極性化合物有更好的保留性能和更高的分離度，其鍵合相與分析物之間還存在極性相互作用，因此具有與傳統的C18填料不同的選擇性，可用于分析一些在反相機制下，在傳統的C18固定相上無保留的極性化合物。綜合考慮，試驗選擇ThermoHypersilGoldAq色譜柱測定CG中GDL的含量。2.3流量對分離度的影響采用ThermoHypersilGoldAq色譜柱（250mmx4.6mm,5pm），流動相為乙腈（9+1）混合溶液，試驗考察了流量分別為0.5,1.0mL-min-1時對GDL和CG分離度的影響，見圖4。由圖4可知：流量為0.5mL?min-1時GDL和CG的峰較寬。在流量分別為1.0,0.5mL?min-1時，GDL和CG的分離度分別為2.68,2.21。根據VanDeernter方程式：式中：H為塔板高度；A,B及C為3個常數，其單位分別為cm,cm?s-1,s;u為載氣的線速率，cm?。在高流量時（u>u），線速率u越大，Cu越大，B/u越小，這時Cu項起主導作用，u增加，H增加，柱效降低［26］。VanDeernter認為線速率在0.1cm-s-1左右時，H最小，柱效最高。根據公式u=20F/3nD2，對于粒徑大于3pm的色譜柱，在線速率為0.1cm?s-1時，內徑D為4.6mm的色譜柱，對應的流動相的最佳流量F為1.0mL-min-1。在流量為1.0mL-min-1時，GDL和CG的分離度好，但GDL的出峰較早，容易受溶劑及其他強極性物質的干擾；在流量為0.5mL-min-1時，GDL和CG的分離度稍低，但仍能滿足分離要求，綜合考慮分離度和保留時間，試驗選擇流量為0.5mL?min-1。2.4標準曲線和檢出限將150mg?L-1的GDL對照品儲備溶液用甲醇逐級稀釋配制成質量濃度分別為1.05,7.50,12.0,15.0,22.5mg?L-1的標準溶液系列，以GDL的質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明：GDL的質量濃度在1.05~22.5mg?L-1內呈線性，線性回歸方程為A=10.462p+10.25，相關系數為0.9995。以3倍信噪比計算方法的檢出限（3S/N）為0.32ng，相當于0.0003%（質量分數，下同）的供試品質量；以10倍信噪比計算測定下限（10S/N）為1.05ng,相當于0.001%的供試品質量。2.5精密度與回收試驗稱取陰性樣品100.0mg共9份，分別加入GDL1.05,148.35,298.76凹各3份，用甲醇溶解并稀釋配制成低、中、高3個濃度水平的溶液，進行加標回收試驗，結果見表1。稱取CG試樣100.0mg共6份，分別加入GDL對照品儲備溶液1.00mL，用甲醇溶解并稀釋至10mL，搖勻，即得供試品加標溶液。夕卜標法定量，計算測定值的相對標準偏差（RSD,n=6）為2.2%；以不同分析人員、不同儀器重復測定，計算RSD為4.7%。結果表明方法的精密度較好。2.6穩定性試驗將對照品溶液和供試品加標溶液于室溫下放置0,1,2,4,6,8,12h后分別進樣，考查方法的穩定性，結果見表2。由表2可知：溶液在12h內穩定性較好。2.7樣品分析按試驗方法對大批量生產的3批CG樣品中的GDL含量進行測定，結果表明，3批樣品中均未檢出GDL殘留。本工作采用帶CAD檢測器的高效液相色譜法快速測定GDL含量。方法具備操作簡單、靈敏度高、選擇性好的特點，樣品無需衍生化即可直接測定CG中GDL的含量。【相關文獻】[1]RENANM,ARNOULT-DELESTV,PAQUETD,etal.Changesintherheologicalpropertiesofstirredacidmilkgelsasinducedbytheacidificationprocedure[J].DairyScienceandTechnology,2008,88(3):341-353.[2]TAKEUCHIKP,CUNHARL.InfluenceofageingtimeonsodiumcaseinategelationinducedbygluconoS-lactoneatdifferenttemperatures[J].DairyScienceandTechnology,2008,88(6):667-681.[3]岳振峰，吳暉.D-葡萄糖酸-S-內酯在食品工業中的應用[J].食品科技，1998(6):32-33.[4]DESAISJ,PARIHARJA,PATELJM,etal.Processforpreparationandpurificationofcanagliflozin:US20160002275[P].2016-01-07.[5]MENGW,ELLSWORTHBA,NIRSCHLAA,etal.Discoveryofdapagliflozin:apotent,selectiverenalsodium-dependentglucosecotransporter2(SGLT2)inhibitorforthetreatmentoftype2diabetes[J].JournalofMedicinalChemistry,2008,51(5):1145-1149.[6]HRAPCHAKM,LATLIB,WANGXJ,etal.Synthesisofempagliflozin,anovelandselectivesodiumglucoseco-transporter-2inhibitor,labeledwithcarbon-14andcarbon-13[J].JournalofLabelledCompoundsandRadiopharmaceuticals,2014,57(12):687-694.[7]ACTONJC,DICKRL.Curedpigmentandcolordevelopmentinfermentedsausagecontaininggluconodelta-lactone[J].JournalofFoodProtection?,1977,40(6):398-401.[8]INSNo.575Glucono-S-Lactone(Glucono-Delta-Lactone,Gluconolactone,Delta-Gluconolactone,GDL[S].[9]陳建文，朱友亮，丁鳳蘭，等.食品添加劑D-葡萄糖酸-S-內酯含量的測定方法研究[J].預防醫學論壇，2009(5):434-436.[10]GB/T9695.17-2008肉與肉制品葡萄糖酸-8-內酯含量的測定[S].[11]LAKERMF,MOUNTJN.Mannitolestimationinbiologicalfluidsbygas-liquidchromatographyoftrimethylsilylderivatives[J].ClinicalChemistry,1980,26(3):441-443.[12]張協光，劉文麗，曾泳艇，等.氣相色譜-質譜法測定食品中葡萄糖酸-8-內酯[J].化學分析計量，2015,24(3):27-29.[13]張協光，劉文麗，鄭彥婕.高效液相色譜法測定食品中的葡萄糖酸-8-內酯[J].中國食品添加劑，2015(9):161-167.[14]文紅，朱寬正.HPLC測定內酯豆腐中葡萄糖酸-8-內酯[J].中國衛生檢驗雜志，2008,18(9):1776-1777.[15]姜友青，梁鄂平，汪經環.高效液相色譜分析糖、糖酸和葡萄糖酸-8-內酯[J].分析測試通報,1988,7(6):25-27.[16]LARCHERR,NICOLINIG,VILLEGASTR,etal.Determinationofgluconicacidinwineusinghighpressureliquidchromatographywithpulsedamperometricdetection[J].Vitis-Geilweilerhof-,2009,48(4):201-204.[17]HUTCHINSONJP,LIJ,FARRELLW,etal.Universalresponsemodelforacoronachargedaerosoldetector[J].JournalofChromatographyA,2010,1217(47):7418-7427.[18]PISTORINOM,PFEIFERBA.Polyketideanalysisusingmassspectrometry,evaporativelightscattering,andchargedaerosoldetectorsystems[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2008,390(4):1189-1193.[19]GUOS,LIUJ,ZHENGY,etal.Characterizationoftranscriptomedynamicsduringwatermelonfruitdevelopment:sequencing,assembly,annotationandgeneexpressionprofiles[J].BMCGenomics,2011,12(1):454-466.[20]NIHIRAT,SUZUKIE,KITAOKAM,etal.Discoveryof&-1,4-D-mannosyl-N-acetyl-D-glucosaminephosphorylaseinvolvedinthemetabolismofN-glycans[J].JournalofBiologicalChemistry,2013,288(38):27366-27374.[21]LIRP,YUANQ,HUANGYP,etal.Hydrophilicinteractionchromatographyonsilicacolumn:retentionmechanismanditsinfluentialfactors[J].ChineseJournalofChromatography,2014,32(7):675-681.[22]OKABEH,HUISP,FUDAH,etal.Massspectrometricquantificationofamphipathic,polyph