小鼠脾虛便秘模型的建立及d-木糖含量測定

便秘是指排便次數的減少，大便不暢、疲勞、困難，大便干燥和困難。這不僅是一種疾病，也是其他疾病的常見并發癥。隨著飲食結構、疾病譜的變化,以及精神心理和社會因素對疾病的影響,便秘的發病率逐漸增加,我國成年人群便秘患病率約為3%~17%。本文采用復合因素的方法建立小鼠脾虛便秘模型,旨在探討便秘的發病以及中藥治療機制。1材料表面1.1實驗動物及飼養環境清潔級SPF昆明小鼠105只,雌雄各半,體重(20±2)g,由廣東醫學院動物中心提供(合格證號:2006A028),飼養于廣東醫學院實驗動物中心,常規飼養7天以適應環境。1.2樣品及飲料的制備取番瀉葉500g,加10倍量沸水浸泡10min,濾過,將濾液在75℃水浴中蒸發濃縮成100%(每升含1kg生藥)的水煎液。白術、枳實按2:1比例組成,先浸泡30min,按1:10比例加蒸餾水,電爐文火煎煮40min,沙布過濾,濾渣加6倍量清水,文火煎煮40min,紗布過濾,合并兩次煎液。將濾液在75℃水浴中蒸發濃縮成100%的水煎液。以上中藥均購自廣東醫學院附屬醫院藥房。便秘通口服液:廣州中一藥廠生產,批號:97040013。D-木糖液的制備:上海伯奧生物科技有限公司,用蒸餾水按3%比例配制。血清D-木糖試劑盒:南京建成生物有限公司。2方法2.1造模、養焦、飲水將小鼠雌雄分籠飼養,保持適宜的環境(室溫23℃~25℃,相對濕度50%~70%,清潔安靜),適應性喂養7天后開始造模。具體步驟如下:第1天~7天,造模組用番瀉葉按0.8ml/d灌胃,正常飲食飲水,造成脾虛模型;第8天起停用番瀉葉,采用饑飽失常方法延續脾虛狀態。隔天喂低纖維飼料生大米4~8g,自由飲水1次,每次0.5h。在脾虛模型的基礎上,采用限制飲水和控制飲食方法造成便秘模型,造模時間共15天。2.2前藥劑量計算造模前隨機設正常對照組15只和造模組90只。造模成功后將造模組小鼠再隨機分為模型組,枳術丸大、中、小劑量組,便秘通組,蒸餾水組。按正常成人與小鼠給藥劑量系數折算,根據公式:小鼠劑量=W×人劑量(W為小鼠與人的折算系數),計算出小鼠每日給藥劑量,枳術丸按大(2倍于臨床等效量)、中(臨床等效量)、小(0.5倍于臨床等效量)三個劑量給藥,相當于含生藥量分別為18、9和4.5g/kg。便秘通按中劑量(臨床等效量)給藥,給藥量為6mL/kg。蒸餾水按中劑量給藥,給水量為6mL/kg。2.3觀察小鼠的變化實驗期間,每日觀察、記錄各組大鼠的食量、體質量、糞便等情況。2.4大傳統中大鼠的解剖小鼠外觀干癟、瘦小、豎毛、拱背、活動減少,體重減輕,大便干結、數量減少、顆粒細小;解剖見大便集結在結腸,呈球狀或串珠狀,空腸、回腸無明顯糞便殘留;腸道推進率和血清D-木糖水平降低。2.5方法模型組模型第17~24天,除正常對照組外,各組小鼠每天喂生大米4~8g,自由飲水1次,每次0.5h。除模型組外,各組小鼠分別用枳術丸湯劑大、中、小三個劑量及便秘通、蒸餾水對照治療。第24天后動物實驗結束,進行各項指標檢測。2.6腸道長度和活性炭混懸液推進長度測定造模成功及治療組停藥后,禁食禁水24h,給小鼠灌D-木糖液40min后經口灌入活性炭懸液0.1ml/10g(懸液濃度100g/L),20min后眼球取血處死,立即剖腹取出幽門到直腸末段的全部腸道,在無張力狀況下測量腸道全長及活性炭混懸液在腸道內推進長度,并計算活性炭懸液推進長度占腸道全長的百分比(黑染腸管長度/腸管總長度)。2.7小鼠3.d-木糖溶液的配制禁食24h,按10ml/(kg·d)劑量給予小鼠3%D-木糖溶液灌服,1h后眼球取血。離心制備血清,按照D-木糖試劑盒說明書所述,應用比色分析法測定各組小鼠血清D-木糖含量。2.8多樣性均數擬合采用SPSS13.0統計軟件進行分析,計量資料用(x±s)表示,多樣本均數比較用單因素方差分析,先進行方差齊性檢驗,當方差齊時用Bonferroni法進行比較,當方差不齊時用Tamhane’sT2法。3結果3.1各組大鼠前病理情況比較(1)正常對照組:眼睛有神,活動快速,背毛濃密而有光澤,飲食、飲水適中,大便正常。(2)模型組:造模第3天大鼠開始出現豎毛、背毛失去光澤、拱背、活動減少、繼之、被毛枯槁、倦臥、嗜睡、四肢無力、便塘、肛周污穢、進食量減少、消瘦、干癟,造模第10天后出現便秘癥狀,大便數量減少、顆粒變小、質硬且上述脾虛癥狀持續存在。解剖見大便集結在結腸,呈球狀或串珠狀,空腸、回腸無明顯糞便殘留。(3)各治療組:治療后第4天起,一般情況逐漸好轉,進食量增多、活躍、便秘癥狀消失,大便數量增多、顆粒大、質軟。(4)蒸餾水組:小鼠消瘦,干癟,背毛無光澤、活動不多、進食量少、大便干結、數量少、顆粒小、質硬,脾虛和便秘的癥狀均無明顯改善。3.2比較各組大鼠的實驗指標各組小鼠實驗指標比較見表1。4項目研究的結果目前的便秘模型主要有燥結失水模型、氣虛模型、陽虛模型、復方地芬諾酯模型,但是對既與病因病機相符合,又能體現與“證”相似的主要癥狀的中醫證型的便秘模型的研究尚少。我們在分析和總結上述模型研究的基礎上,從造模的思路、理論依據、指標觀察和藥物治療等幾個方面進行了總結和思考,認為在模型的研制上應綜合以下三個方面條件:(1)由類似的病因所引起。(2)出現與“病”和“證”相似的癥狀。(3)結合臨床的治療方案和大體相同的劑量方藥治療有效。用瀉劑致脾虛是目前較為經典的脾虛模型造模方法,并且也有學者長期用瀉劑的方法來研制慢傳輸型便秘模型。因此,可以說瀉劑在脾虛便秘模型的研制中是唯一的選擇,既切合脾氣虛,又可符合便秘的病理改變。我們在前期造模過程中,首選番瀉葉造成脾虛模型,同時綜合考慮了便秘的發病非單因素所致,如長期飲食減少,對腸道的刺激減少進一步導致腸道的蠕動減慢等因素,且從中醫病因病機的角度也認為,饑飽失常可以導致脾虛。因此,綜合上述理論基礎,采用饑飽失常、限制飲食的方法繼續施加脾虛因素,同時予以限制飲水和低纖維飲食等方法造成便秘模型,應用多因素造模方法研制成脾虛便秘模型,即能符合便秘的發病原因,又能客觀地體現中醫“證”的特點。本實驗結果可見,模型組小鼠出現了脾虛和大便干結的表現,既具有脾虛的證的特點,又具備了便秘癥狀,說明本模型復制的方法是符合中醫病證模型研究思路的。經藥物治療后,小鼠脾虛和便秘的癥狀均有所緩解,體重增加,尤其以枳術丸大、中劑量組效果最明顯,而蒸餾水組則無明顯改善。客觀指標與證具有密切的相關性,是疾病診斷的客觀依據,因此選擇與本證相關性高且較全面的實驗指標是必不可少的。腸道推進性運動是胃腸平滑肌在神經、體液因素調節下電活動、機械活動協調的結果,因此檢測腸道推進功能可以準確地反映胃腸動力狀態;血清D-木糖吸收率是驗證脾虛的經典指標