龍腦樟揮發油化學成分及生物活性研究

龍腦（c10h17h）作為一種稀有的中藥或食品添加劑，是龍腦產品中不可或缺的良好佐劑。在我國,龍腦用作藥物的歷史超過1500年。按照來源不同,龍腦可分為合成龍腦(syntheticborneol)和天然龍腦(naturalborneol)兩類。合成龍腦是由人工合成的一種右旋龍腦(D-borneol)和異龍腦(isoborneol)混合物,其中右旋龍腦組成比例不得少于55.0%;天然龍腦則是右旋龍腦比例大于95%的天然植物提取物。近年來,由于天然龍腦可提取資源匱乏和本身價格的昂貴,許多中藥配方的天然龍腦成分被合成龍腦取而代之。然而,合成龍腦具有一定的風險,在于其長時間儲存過程中可轉變為樟腦(camphor)。樟腦作為一種較強毒性物質可導致一系列健康安全問題,已經引起人們廣泛關注。因此,在龍腦產品中選用天然龍腦是人們追求自然健康生活的必然趨勢。天然龍腦可從植物揮發油中提取,包括龍腦香科類(如龍腦香樹)、唇形科類(如迷迭香和鼠尾草)、敗醬科類(如纈草)和菊科類(如洋甘菊)等植物。由于這些原料植物的短缺,天然龍腦的價格逐年上升。之前我們研究發現,在我國廣東地區生長的梅片樹葉中含有天然龍腦并具備良好的使用安全性。這一發現為提取天然龍腦提供了新的原料來源。最近,我們又發現龍腦樟(Cinnamomumcamphorachvar.Borneol)新鮮樹葉提取得到的揮發油中也富含右旋龍腦,而且這種植物在華南地區生長更為廣泛。目前而言,可查文獻中還未曾報道龍腦樟鮮葉揮發油的生物活性,尤其在抗菌活性方面。因此,本實驗通過水蒸汽蒸餾方法提取龍腦樟鮮葉中揮發油,采用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術鑒定其化學組成;采用K-B紙片擴散法和最小抑菌濃度(MinimalInhibitionConcentration,MIC)實驗來評估龍腦樟揮發油的抗菌活性。1材料和方法1.1培養基和儀器新鮮龍腦樟樹葉采自中國科學院華南植物園(廣州),并由該所朱亮峰教授對植物體進行分類鑒定和確認;實驗所用天然右旋龍腦從龍腦樟樹葉揮發油中升華結晶而得,由廣東嘉應制藥股份有限公司完成;右旋龍腦標準品購自中國藥品生物制品檢定所,右旋龍腦成分99.90%,分子量154.24;慶大霉素藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司,含藥量10μg/片;硫酸慶大霉素購自廣州拜爾迪生物技術有限公司,由美國Sigma公司分裝;二甲基亞砜(DMSO100%)、沙保羅液體培養基(SD)、水解酪蛋白肉湯培養基(MH)購自廣州環凱微生物科技有限公司;瓊脂購自廣州國奧生物技術有限公司;正己烷購自國藥集團化學試劑有限公司,色譜純;MIC專用96孔聚苯乙烯板、無水硫酸鈉購自廣州維寧生物科技有限公司,密閉已滅菌和分析純;兩種革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaCCTCCAB93066和大腸桿菌EscherichiacoliCTCCAB91112)、兩種革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌BacillussubtilisCCTCCAB92068和金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCCTCCAB91053)、兩種酵母菌(異常漢遜氏酵母HansenulaanomalaCCTCCAY92046和啤酒酵母SaccharomycescerevisiaeCCTCCAY92042)、兩種霉菌(黑曲霉AspergillusnigerCTCCAF91004和球毛殼霉ChaetomiumglobosumCCTCCAF200039)均由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)提供。6890-5975型GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀器美國Aglient公司;Clevenger型水蒸餾設備河北精威實驗儀器有限公司;Ⅲ型SHZ-D循環水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;SterillGARD牌III型Advance級無菌超凈操作臺美國Baker公司。1.2實驗方法1.2.1揮發油的提取采集新鮮龍腦樟樹葉粉碎,按《中國藥典》(2010版)附錄XD的水蒸氣蒸餾法提取揮發油。采用蒸餾裝置對500~700g新鮮龍腦樟樹葉水蒸餾2h;收集餾出物后,投入過量無水硫酸鈉并充分振蕩;使用循環水式真空泵抽濾裝置,對混合物進行抽濾,所得不含水分透明油狀物即為揮發油。稱量、計算揮發油的得率。1.2.2揮發油標定在HP-5MS柱上使用一系列同源性C8~C25正烷烴對所有揮發成分進行科瓦茨指數(Kovatsindices)標定。揮發油溶解于適量的正己烷,通過與標準品共注入進行分析,并通過與Wiley(V.7.0)和國家標準與技術協會V.2.0GC-MS數據庫比對科瓦茨指數進一步確認。各組分相關濃度通過峰面積歸一化法計算求出各化合物的峰面積相對含量。1.2.2.進樣量與溫度色譜柱:HP-5MS彈性石英毛細柱管(30m×0.25mm,0.25μm);升溫程序:40℃保留1min,3℃/min的速度升溫至250℃后,保持20min。進樣量:1μL;進樣口溫度為250℃;載氣為氦氣,恒定流速1mL/min。1.2.2.電子倍增器電壓電子轟擊(EI)離子源;電子能量70eV;傳輸線溫度280℃;離子源溫度230℃;發射電流34.6VA,電子倍增器電壓1392V;掃描質量范圍m/z33~450。1.2.3小柱體mha培養測試前,取標準菌株進行活化:四種所選細菌活化于水解酪蛋白瓊脂培養基(MHA)平板上,在37℃培養箱中培養24h;兩種所選酵母菌活化于沙保羅瓊脂培養基(SDA)平板上,在28℃培養箱中培養48h;兩種所選霉菌活化于SDA平板上,在28℃培養箱中培養120h。1.2.3.1.懸掛式細菌懸浮液在無菌操作臺中,挑取活化平板上1~2個單菌落溶于無菌生理鹽水中,校正至0.5麥氏標準濁度,制備上述三類所選微生物的菌懸液。1.2.3.抗菌活性的測定采用美國臨床實驗室標準化委員會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstituteofAmerica,CLSI-2012)推薦的K-B紙片擴散法,用于測定揮發油及其組分天然右旋龍腦的抑菌能力。先制備相應的平板,取滅菌后冷卻至55℃的MHA或SDA,在無菌操作臺上,將其傾注入無菌培養皿中,使瓊脂厚度3~4mm,待其冷卻至固體,備用。再制備含菌平板,立即取0.1mL標準菌懸液(含106~107CFU/mL)滴入培養基,涂布均勻,加蓋室溫靜置5min。然后,取1.5g揮發油、1.5g右旋龍腦分別溶于1mL100%DMSO制成相應混合物,緊接著各取10μL分別滴入直徑為6mm的無菌濾紙片上,制成含揮發油或右旋龍腦測試紙片。同時,取等體積的100%DMSO和無菌水分別滴入同樣的無菌濾紙片作為陰性對照組;慶大霉素藥敏紙片(每片含藥量10μg)為陽性對照組。最后,在無菌條件下輕輕將上述實驗紙片貼在各種含菌平板上,彼此紙片均勻隔開。接種后的平板,所選細菌置于37℃條件下培養24h;所選酵母菌于28℃下培養48h;所選霉菌于28℃下培養120h。通過測量抑菌直徑來評估抗菌活性。重復三次實驗,結果以平均數±標準偏差來表示。1.2.3.mic的設置采用美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI-2012)推薦的微量肉湯稀釋法,來測定揮發油及其組分天然右旋龍腦的最小抑菌濃度。慶大霉素、揮發油和右旋龍腦的儲液配制和稀釋方法,參考CLSI-2012推薦方法。慶大霉素采用無菌水配制儲液和稀釋,揮發油和右旋龍腦都采用100%DMSO配制儲液和稀釋,稀釋時各藥物濃度都分別稀釋至40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08mg/mL。先進行MIC板制備,在無菌操作臺中進行,將上述不同濃度的相關物質溶液分別加入到滅菌的96孔聚苯乙烯板中,第1至第10孔加藥液,每孔10μL,第11和12孔分別加入等量100%DMSO和無菌水作為空白對照。再接種,取濃度相當于0.5麥氏標準濁度的各類菌株的菌懸液,取經離子校正后的無菌MH肉湯(針對四種所選細菌而言)或SD(針對所選酵母菌和霉菌而言),按1∶1000稀釋后得到相應含菌稀釋液,然后取稀釋液90μL加入上述處理過的MIC板孔中,密封后培養。此時,第1孔至第10孔藥物濃度分別為2000、1000、500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81μg/mL。培養條件:接有細菌的MIC板置于37℃培養箱培養20h;接有酵母菌的MIC板置于28℃培養箱培養48h;接有霉菌的MIC板置于28℃培養箱培養96h。以微孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為該物質的MIC值。重復三次平行實驗。2結果與分析2.1油中主要化學成分參照藥典方法,采用水蒸汽蒸餾法從新鮮龍腦樟樹葉中提取揮發油。真空抽濾后所得的不含水分透明油狀物即為揮發油。500~700g的新鮮龍腦樟樹葉,在一定工藝條件下可得揮發油6.2~8.6g。通過提取率(%)=揮發油的質量/龍腦樟樹葉的質量×100,計算出其提取率平均值為1.23%(w/w)。通過GC-MS鑒定出揮發油中含有27種化學組成成分,占總油量98.14%,其中單萜烯烴類17.16%,氧化單萜烯烴類6.28%,倍半萜烯烴類2.37%,氧化倍半萜烯烴類81.93%(如表1所示)。主要成分為右旋龍腦(81.58%),樟腦油(2.96%),α-蒎烯(2.03%),右旋檸檬烯(1.64%),1,8-桉葉油素(1.60%)和莰烯(1.54%)。結果顯示,該龍腦樟樹葉揮發油的右旋龍腦含量還是可觀的。國外學者研究報道在龍腦香科、唇形科等植物樹葉揮發油中含有豐富的龍腦,有些含量高達90%,但遺憾的是這些植物的龍腦大部分是屬于左旋龍腦。而我國卻擁有可提取右旋龍腦的豐富植物資源。本課題組之前研究就發現,一種廣泛生長于華南地區的梅片植物,其樹葉揮發油中就富含天然右旋龍腦,含量達78.46%,且揮發油提取率為0.60%。但本實驗結果表明,與梅片樹葉相比,采用同樣的水蒸餾工藝條件,龍腦樟樹葉中揮發油的提取率更高達到1.23%,且揮發油中右旋龍腦的含量更高,達到81.93%。加上龍腦樟這種植物在環境中生長區域廣,因此龍腦樟可作為生產右旋龍腦的重要原材料。2.2揮發油及右旋龍腦的抑菌活性三類微生物(細菌、酵母菌和霉菌)的抑菌圈測定結果如圖1所示,三次重復實驗中每個所測抑菌圈直徑已包含測試用濾紙片的直徑。測試中揮發油及其組分右旋龍腦的實驗劑量均為每個紙片15μg,而標準抗生素慶大霉素的實驗劑量為每個紙片10μg。同樣實驗條件下的DMSO和無菌水對照組均無可用數據測定(圖中未顯示),即均無抑菌效果。從圖1中可看出,揮發油及右旋龍腦的對所試三類菌株的抑菌效果相似,除了枯草芽孢桿菌。二者均對啤酒酵母和黑曲霉效果不明顯,但對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、球毛殼霉和異常漢遜氏酵母均有一定的抑菌效果,且抑菌活性從強到弱依次為:球毛殼霉>大腸桿菌>銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌>異常漢遜氏酵母。值得注意的是,對枯草芽孢桿菌而言,揮發油的抑菌活性明顯比其組分右旋龍腦的強,預示著揮發油其他某些組分可能對該菌有明顯的抑菌作用,有待于進一步實驗確定。同時,從圖1中可知,提取的揮發油的抑菌活性普遍都比右旋龍腦的活性高。之前研究表明,樟科樹葉揮發油中含有除右旋龍腦外的其他抑菌成分,如檸檬烯、β-水芹烯、α-水芹烯、γ-桉油醇、β-丁子香烯、α-蒎烯等,因此,本實驗中出現相似結果可能與龍腦樟揮發油中含有其它具有抑菌或者協同抑菌作用成分有關。2.3揮發油及其組分右旋龍腦的mic值分布情況三類菌株的MIC值測定結果見表2,空白對照組(含有100%DMSO和無菌水的微孔)上均有相應的所測菌的生長。揮發油及右旋龍腦均有抑菌作用,有著較為廣譜的抑菌性能。但揮發油的MIC值普遍比其組分右旋龍腦小,表明前者抑菌作用較為明顯。與抗生素慶大霉素相比,揮發油及其組分右旋龍腦對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的MIC值均相同,說明這種天然物質在抑制這兩類細菌生長方面一定程度上可以替代慶大霉素的抑菌功效。而且從結果知,針對啤酒酵母而言,揮發油比慶大霉素的MIC值還低,這就說明前者對啤酒酵母的抑菌功效甚至超過慶大霉素的抗生素抑菌能力,有待于進一步研究確定。3揮發油的抑菌活性本實驗取材于華南地區廣泛生長的龍腦樟這種植物,取其新鮮樹葉采用水蒸汽蒸餾法提取樹葉揮發油,并采用氣相色譜-質譜聯用儀分析所得揮發油的化學組成及其含量,同時又對該揮發油及其組分右旋龍腦選用K-B紙片瓊脂擴散法和微量肉湯烯釋法分別測其抑菌圈直徑和最小抑菌濃度,來比較這兩種物質對本實驗所選細菌、酵母菌和霉菌三類微生物的抑菌性能。實驗結果表明:a.龍腦樟新鮮樹葉揮發油水蒸餾提取率可達到1.23%(w/w);氣相色譜-質譜聯合分析知,該揮發油含有27種有機組分且占總油量的98.14%,但以三種成分為主,分別是右旋龍腦(81.58%)、樟腦(2.96%)和α-蒎烯(2.03%);b.在抑菌活性方面,該揮發油