實(shí)驗(yàn)12植物多胺的薄層層析

——熒光測定法實(shí)驗(yàn)12植物多胺的薄層層析

——熒光測定法1【多胺的作用】

多胺：具有強(qiáng)生物活性的低分子脂肪族含氮堿類似于激素，含量稍高，移動(dòng)性差膜的穩(wěn)定延緩衰老滲透調(diào)節(jié)劑抑制乙烯合成【多胺的作用】

多胺：具有強(qiáng)生物活性的低分子脂肪族含氮堿類2層析法（chromatography）是利用物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間的分配差異以分離混合物的方法。

按照固定相的形式分：柱層析、薄層層析、紙層析等【實(shí)驗(yàn)原理】層析法（chromatography）是利用物質(zhì)在固定相3薄層層析是吸附層析的一種，將吸附劑如硅膠或鋁土均勻涂布于在鋁片、膠片或玻璃板上形成薄層，作為層析固定相（stationaryphase），再將混合物樣品點(diǎn)附在此薄層固定相相上，以液體展開劑作為流動(dòng)相（mobilephase），透過毛細(xì)作用由下往上移動(dòng)。由于不同的化合物與固定相之間吸附力，和流動(dòng)相間溶解度的差異，當(dāng)展開劑上升、流經(jīng)所吸附的樣點(diǎn)時(shí)，吸附力弱的物質(zhì)移動(dòng)快，吸附力強(qiáng)的移動(dòng)慢。由于各種物質(zhì)移動(dòng)的速率不同，使混合物最后在固定相薄層上分開，達(dá)到分離目的。薄層層析是吸附層析的一種，將吸附劑如硅膠或鋁土均勻涂布于在鋁4Rf值：一種化合物在層析板上上升的高度與展開劑上升高度的比值，Rf是化合物在該分析條件下的特性參數(shù)。利用Rf值，可以判斷兩化合物是否為相同的化合物；也可用于判斷混合物中至少含有多少種成分Rf值：一種化合物在層析板上上升的高度與展開劑上升高度的比值5多胺屬脂肪族直鏈胺類，以前主要用氨基酸分析儀和紙電泳等方法測定，目前多用衍生化的方法，即將多胺的一、二級(jí)氨基接在對(duì)熒光或紫外光有吸收的基團(tuán)上，再通過薄層或液相色譜分離檢測。常用的衍生試劑有丹磺酰氯、苯甲酰氯、苯磺酰氯及熒光胺類等。【測定方法】多胺屬脂肪族直鏈胺類，以前主要用氨基酸分析儀和紙電泳等方法測6試劑高氯酸（5%）、脯氨酸（100mg/ml水）、氯仿、三乙胺、碳酸鈉（飽和溶液）、乙酸乙酯、丹磺酰氯（5mg/ml丙酮，可以少如一半，以減少試劑熒光干擾）神經(jīng)性毒物，致癌Dansylchloride二甲基氨基萘磺酰氯C12H12ClNO2S;FW269.7

設(shè)備高速冷凍離心機(jī)，熒光分光光度計(jì)，三用紫外分析儀，微量進(jìn)樣器，層析硅酸薄板（G8x18cm），電吹風(fēng)，層析缸，離心管。【材料與設(shè)備】試劑【材料與設(shè)備】7材料2周小麥幼苗葉片；大豆、玉米、小麥胚-20oC處理（10個(gè)）材料8【實(shí)驗(yàn)步驟】

層析板的制作材料：硅膠、氧化鋁、纖維素粉、DEAE纖維素、瓊脂、葡聚糖厚度：0.25mm,110度活化1小時(shí),用前溫化稱取層析用硅膠（G60）4克于研缽內(nèi)，加入12ml（+/-1ml）5%淀粉水溶液(含0.1%HBO3)磨勻，將硅膠傾倒于層析用玻璃板（8x18cm）上，鋪平。涼干(2h,1017通風(fēng)櫥中)，置110oC烘箱內(nèi)烘干活化（30分鐘，1019干燥箱中）。板子的質(zhì)量與研磨的力度、時(shí)間有關(guān)。研磨時(shí)間越長，越凝固。研磨時(shí)間短、稀，控制時(shí)間與力度。一般用力5分鐘可以【實(shí)驗(yàn)步驟】層析板的制作9精胺(SpmsperminC10H26N4Mr:202.3)亞精胺(SpermidineMr145.2)尸胺(CadecineMr102)1,5-DiaminopentanedihydrochlorideFW175.1>98%腐胺(PutrecineMr88.15)1,4-DiaminobutanedihydrochlorideFW161.08>98%均分別用5%高氯酸配制成10、1、0.1、0.01mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液。【多胺標(biāo)準(zhǔn)液的配制】精胺(SpmsperminC10H26N4Mr:2010【多胺粗提液的制備】300mg新鮮小麥葉片（取自葉片中段）用3ml冰冷的5%高氯酸分?jǐn)?shù)次在小研缽里研磨，研磨液合并，在冰浴中浸提1小時(shí)（其間搖晃數(shù)次）。然后高速離心（15000g，20min，4oC），其上清液即為多胺粗提液，也可用青霉素瓶裝保存于-25oC冰箱中。（1克葉片足夠+5ml冰冷的5%高氯酸）【多胺粗提液的制備】300mg新鮮小麥葉片（取自葉片中段）用11400μl多胺粗提液+400μl丹磺酰氯+300μl飽和碳酸鈉↓攪拌、室溫、黑暗中過夜（60度水浴25min，可當(dāng)天完成）+100μl脯氨酸↓攪拌、室溫中反應(yīng)30min+500μl苯↓攪拌、靜置取有機(jī)相↓層析【丹磺化與萃取】標(biāo)樣丹磺化第1組—精胺第2組—亞精胺第3組—尸胺第4組—腐胺第5組—混合標(biāo)樣400μl多胺粗提液+400μl丹磺酰氯+300μl飽和碳酸12點(diǎn)樣：先用鉛筆在層析片上距底端約1.5cm處輕輕畫一條橫線作為起始線，再畫一條短線垂直于起始線，作為樣品的點(diǎn)樣點(diǎn)。可在起始線上點(diǎn)3個(gè)樣品（單一標(biāo)樣、混合標(biāo)樣及自提樣品），一起排列展開，但是相鄰距離及樣點(diǎn)與層析板邊緣距離均應(yīng)至少保持3cm，以避免展開時(shí)因擴(kuò)散而導(dǎo)致樣品重疊。【層析】注意：請(qǐng)每個(gè)人在點(diǎn)樣前，在層析板背面上方寫上名字和學(xué)號(hào)點(diǎn)樣：先用鉛筆在層析片上距底端約1.5cm處輕輕畫一條橫線作13用微量進(jìn)樣器點(diǎn)2~20ul多胺丹磺化合物的苯提取液于硅膠薄板，以垂直的角度快速、輕巧地點(diǎn)樣后，移開針頭，讓溶劑揮發(fā)。樣點(diǎn)的直徑不宜過大，小于0.3-0.5cm，樣點(diǎn)越小，分離效果越好。當(dāng)樣點(diǎn)過大時(shí)時(shí)，Rf值相近的點(diǎn)常因擴(kuò)散現(xiàn)象而重疊不易區(qū)分，導(dǎo)致分離的效果變差。用過的針頭，以紙巾將管內(nèi)的溶液吸引出，再用干淨(jìng)的溶劑潤洗2-3次，就可以重復(fù)使用，繼續(xù)在層析片上點(diǎn)下一個(gè)樣品。溶劑揮發(fā)后，層析板放在密閉且充滿飽和蒸汽的展開槽中展開45~60min（展開劑為氯仿：三乙胺=100：20V/V液面不能高過樣點(diǎn),密閉層析,溶劑飽和）當(dāng)展開劑到達(dá)頂端邊緣時(shí)，立即以鉛筆標(biāo)出展開劑的前沿位置，用電吹風(fēng)吹干薄板，并置紫外分析儀下對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)多胺，用鉛筆劃出各多胺斑點(diǎn)，求出各類多胺的Rf值。用微量進(jìn)樣器點(diǎn)2~20ul多胺丹磺化合物的苯提取液于硅膠薄板14

(254nm紫外燈，用酒精洗加樣器,被分離物Rf0.5-0.8之間,Rf大于0.05可以區(qū)別)由于多胺分子中含有氨基團(tuán)，它易與固定相硅羥基Si-OH發(fā)生吸附，故在流動(dòng)相中加入三乙胺。如果不加，SPM/SPD不能分離，而太多的三乙胺會(huì)使色譜峰產(chǎn)生拖尾。(254nm紫外燈，用酒精洗加樣器,被分離物Rf0.15將上述薄板上的各點(diǎn)多胺衍生物的斑點(diǎn)用刀片刮下，并溶于5ml乙