實(shí)驗(yàn)八聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離血紅蛋白1一、目的要求1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)2.學(xué)習(xí)和掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)2電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程。電泳條件：水溶液（緩沖液）、支持物（區(qū)帶電泳）、電場(chǎng)（電泳儀、電泳槽）電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳、穩(wěn)態(tài)電泳等。區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移，分離成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是為了防止機(jī)械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產(chǎn)生的對(duì)流。區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹(shù)脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。二、定義與分類3聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(簡(jiǎn)稱AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。4丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠特點(diǎn)：在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；無(wú)吸附和電滲作用，樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。5根據(jù)介質(zhì)是否均一，可分為連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳移動(dòng)方向：帶電性質(zhì)決定。蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸及其衍生物等物質(zhì)都具有許多可解離的酸性和堿性基團(tuán)，它們?cè)谌芤褐袝?huì)解離而帶電。一般說(shuō)來(lái)，在堿性溶液中（即溶液的pH值大于等電點(diǎn)pI），分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。而在酸性溶液中，分子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。不同的質(zhì)點(diǎn)在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同，常用泳動(dòng)度（或遷移率）來(lái)表示。

泳動(dòng)度：帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的移動(dòng)速度。三、原理67影響泳動(dòng)度的因素：

1顆粒本身：主要取決于帶電質(zhì)點(diǎn)的性質(zhì)，即顆粒所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小和質(zhì)點(diǎn)的形狀。一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，質(zhì)點(diǎn)直徑越小，越接近于球形，則在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度越快；反之，則越慢。

2外界因素：電場(chǎng)強(qiáng)度E、pH、離子強(qiáng)度I、電滲、緩沖液粘度及溫度等。A：電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子

B：電泳開(kāi)始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。

C：蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。電泳過(guò)程示意圖——不連續(xù)電泳加樣加電場(chǎng)，樣品濃縮在界面上電泳結(jié)束濃縮膠分離膠8膠濃度不同；pH值不同不連續(xù)凝膠電泳的分離原理：1、電荷效應(yīng)

各種蛋白質(zhì)所帶電荷不同，有效遷移率也不同。2、樣品的濃縮效應(yīng)

在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有上、下槽緩沖液(Tris-Glycine，pH8.3)、濃縮膠緩沖液(Tris-HCl，pH6.8)、分離膠緩沖液(Tris-HCl，pH8.9)，兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同（濃縮膠孔徑大）。在這種條件下，緩沖系統(tǒng)中的HCl幾乎全部解離成Cl－，兩槽中的Glycine(pI＝6.0)只有很少部分解離成Glycine的負(fù)離子，而酸性蛋白質(zhì)也可解離出負(fù)離子。這些離子在電泳時(shí)都向正極移動(dòng)。Cl－速度最快(先導(dǎo)離子)，其次為蛋白質(zhì)，Glycine負(fù)離子最慢(尾隨離子)。由于Cl－很快超過(guò)蛋白離子，因此在其后面形成一個(gè)電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域，該區(qū)電位梯度最高，這是在電泳過(guò)程中形成的電位梯度的不連續(xù)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和Glycine離子加快移動(dòng)，結(jié)果使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利于提高電泳的分辨率。不連續(xù)凝膠電泳的分離原理：3、分子篩效應(yīng)

蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分離膠后，條件有很大變化。由于其pH升高(pH8.9)，使Glycine解離成負(fù)離子的效應(yīng)增加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)受到影響，遷移率急劇下降。此兩項(xiàng)變化，使Glycine的移動(dòng)超過(guò)蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的電荷、大小和構(gòu)型移動(dòng)。分離膠的孔徑有一定的大小，網(wǎng)孔徑大小不同。分子量和構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)分子，通過(guò)一定孔徑的凝膠時(shí)所受阻力不同，引起泳動(dòng)速度的變化，從而達(dá)到分離目的。

(a)凝膠孔徑不連續(xù)性(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性(c)電位梯度的不連續(xù)性凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。表3.4分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

10420-30 1-4×10415-20

1-5×104-1×10510-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 11SDSSDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只與蛋白的分子量有關(guān)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱SDS）。三、試劑與器材試劑：凝膠貯液（30％ACr-0.8%Bis)10%過(guò)硫酸銨TEMED分離膠緩沖液（3.0MpH8.9Tris－HCl緩沖液）濃縮膠緩沖液（0.5MpH6.8Tris－HCl緩沖液）pH8.3Tris-Gly電極緩沖液考馬斯亮藍(lán)R250染色液

考馬斯亮藍(lán)脫色液

上樣緩沖液：取濃縮膠緩沖液6.25ml、蔗糖10g、SDS2.3g.、1g/L溴酚藍(lán)10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。

器材：雙垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀PAGE電泳裝置14四、操作方法1.制備膠板前的準(zhǔn)備將玻璃板洗干凈、干燥。注意不要用手摸玻璃板內(nèi)側(cè)；玻璃板與膠墊接觸的地方不能有縫隙，以防漏膠。5個(gè)組（10個(gè)人）制兩塊膠15

2.配膠

12%分離膠(10ml)

5%濃縮膠(5ml)試劑名稱所需試劑用量/ml所需試劑用量/ml

水3.83.4凝膠貯液 4.00.83分離膠緩沖液(pH8.8Tris-HCl)2.5—濃縮膠緩沖液(pH6.7Tris-HCl) —

0.6310％SDS0.10.0510%過(guò)硫酸銨 0.10.05

混合后

TEMED 0.0040.005凝膠配制過(guò)程要迅速，一定要混勻后灌膠，注膠一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡.分離膠母液6ml濃縮膠母液3ml+凝膠劑TEMED8ml在分離膠凝固成膠以后（約20-30分鐘），再配濃縮膠溶液