杏仁核神經(jīng)元內(nèi)fos蛋白的光鏡觀察

氣管哮喘受自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)政部系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的影響，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。過去對(duì)哮喘的研究主要集中在外周氣道,近年來人們研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)在哮喘發(fā)作中起重要作用。哮喘發(fā)作可以引起腦內(nèi)多個(gè)核團(tuán)活動(dòng)增強(qiáng)。有研究證實(shí)下丘腦室旁核(PVN)參與哮喘發(fā)作,損毀下丘腦前區(qū)可抑制過敏性哮喘大鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。杏仁核是邊緣系統(tǒng)的一部分,它參與許多自主功能活動(dòng),刺激杏仁核簇能引起呼吸頻率、節(jié)律及幅度的變化;杏仁核簇通過下丘腦可調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)分泌活動(dòng);杏仁核亦是調(diào)控情緒反應(yīng)的重要核團(tuán)之一。但杏仁核是否參與哮喘發(fā)作及其具體機(jī)制如何至今未見報(bào)道。因此,我們用Fos免疫組織化學(xué)法結(jié)合WGA-HRP逆行追蹤技術(shù)研究杏仁核是否參與哮喘發(fā)作及其可能的神經(jīng)調(diào)控機(jī)制。材料和方法1.大鼠單次致敏、激發(fā)、手術(shù)健康雄性成年SD大鼠40只,體重250～350g,由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,在安靜、溫暖(18～25℃)、避強(qiáng)光、晝夜光照節(jié)律(明/暗周期為10/14h)的環(huán)境中預(yù)飼養(yǎng)1周,自由飲水和攝食。大鼠隨機(jī)分成兩大組,(1)實(shí)驗(yàn)組:分為①Fos組(n=8),哮喘大鼠激發(fā)后,進(jìn)行Fos免疫組化染色;②Fos+HRP組(n=8),哮喘大鼠行HRP逆行標(biāo)記結(jié)合Fos免疫組化雙重染色法。(2)對(duì)照組:分為①正常組(n=8),大鼠在上述環(huán)境中飼養(yǎng)48h,不行任何手術(shù);②假手術(shù)組(n=8),大鼠在致敏、激發(fā)及手術(shù)階段只進(jìn)行操作,不涉及任何藥物;③生理鹽水(NS)組(n=8),大鼠在致敏和激發(fā)階段均以NS代替卵蛋白(OVA)混懸液。2.方法2.1超聲霧化mda根據(jù)Elwood等的方法,哮喘模型組大鼠,在第1d和第3d腹腔注射由OVA(100mg)、氫氧化鋁(100mg)和滅活的百日咳桿菌(5×109個(gè))配成的混懸液1ml/次,兩周后用超聲霧化器給大鼠霧化吸入1%OVA生理鹽水溶液(2～3ml/min,顆粒直徑≤5μm),每天1次,每次20min,連續(xù)霧化3d后,大鼠呼吸頻率明顯加快,并出現(xiàn)一系列行為變化(煩躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困難、喘息、肋間肌和腹肌明顯收縮、咳嗽等)。2.2pvn、杏仁核的間腦段pb/pb培育模式對(duì)照組及Fos染色組動(dòng)物,經(jīng)0.4%的戊巴比妥納(60mg/kg)腹腔注射。4%多聚甲醛灌注,固定,取含PVN、杏仁核的間腦段入上述固定液中后固定2～4h,然后浸入4℃含30%蔗糖的PB溶液中,48h至沉底。恒冷切片機(jī)做連續(xù)冠狀冰凍切片,片厚40μm。2.3羊抗兔的血清試驗(yàn)切片浸入新鮮配制的0.3%甲醇雙氧水溶液中,浸泡30min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水漂洗3次(2～3min/次),隨后置入正常山羊血清封閉液,室溫孵育20min,勿洗。然后依次加入兔抗Fos血清(1∶300,SantaCruz)室溫孵育30min,隨后4℃孵育12h,之后進(jìn)入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG及SAHRP,室溫孵育2h,各步驟間均用PBS充分洗滌。繼之用DAB法室溫呈色,顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,終止顯色后貼片,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后鏡下觀察。陰性對(duì)照用PBS代替一抗,其它染色步驟同上。2.4微量進(jìn)樣器wga-hrp哮喘動(dòng)物經(jīng)0.4%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立體定位儀,用前端接有微玻管(直徑為40～60μm)的微量進(jìn)樣器將4%WGA-HRP(Vector)0.05μl緩慢注入一側(cè)PVN(坐標(biāo):AP-1.8,ML0.4,H7.4),存活48h。NS組向一側(cè)PVN內(nèi)注入NS0.05μl,假手術(shù)組只進(jìn)行上述手術(shù),不注入任何液體,縫合后單籠飼養(yǎng),其余步驟同前所述。2.5dab-h12變色法光鏡下選取PVN注射點(diǎn)較準(zhǔn)確的大鼠,切片按Mesulam的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)法進(jìn)行WGA-HRP呈色反應(yīng),隨后用DAB和氯化鈷法加強(qiáng)TMB反應(yīng)產(chǎn)物,用PBS充分洗脫后,以ABC法行Fos的免疫組化染色(DAB-H2O2棕色法呈色),具體步驟同上述Fos免疫組織化學(xué)染色。繼之用DAB法室溫呈色,顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,終止顯色后貼片,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后鏡下觀察。2.6動(dòng)物的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)Fos免疫組化切片中隨機(jī)取每只大鼠內(nèi)側(cè)杏仁核(MeA)和中央杏仁核(CeA)對(duì)應(yīng)的典型平面切片各5張,選取含有HRP/Fos雙標(biāo)神經(jīng)元的間腦連續(xù)冠狀切片,將待測切片置于與計(jì)算機(jī)連接的顯微鏡下(×100),每張切片選取4個(gè)不同視野,用加拿大JD801圖像分析系統(tǒng)觀察計(jì)數(shù),取該例動(dòng)物各平面的平均數(shù),即為該動(dòng)物該核團(tuán)的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),每組8個(gè)動(dòng)物間取平均值,即為該組動(dòng)物該核團(tuán)的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,采用單因素方差分析法,P<0.01表示差異有顯著性意義。杏仁核上fos、hrp單標(biāo)神經(jīng)元的分布哮喘時(shí)杏仁核和PVN內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)光鏡下觀察,正常組、假手術(shù)組和NS組大鼠下丘腦室旁核(PVN)、內(nèi)側(cè)杏仁核(MeA)、中央杏仁核(CeA)等核團(tuán)內(nèi)均可見散在的Fos免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)分布,多為淺染,數(shù)量很少,且無密集分布區(qū),組間無明顯差別(故僅以生理鹽水組圖片作為對(duì)比,Fig.1A)。哮喘發(fā)作后,MeA、CeA、PVN內(nèi)Fos免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)呈雙側(cè)分布(Figs.1B-D),與正常組、假手術(shù)組和NS組的Fos表達(dá)數(shù)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均具有顯著性差異(P<0.01,Fig.2)。所有Fos陰性對(duì)照切片上均呈陰性反應(yīng)。杏仁核內(nèi)Fos、HRP單標(biāo)神經(jīng)元和HRP/Fos雙標(biāo)神經(jīng)元的分布情況WGA-HRP注射區(qū)局限于一側(cè)的PVN(Fig.2A),即光鏡下可見WGA-HRP藍(lán)色反應(yīng)物集中于左側(cè)PVN。Fos陽性神經(jīng)元的胞核呈棕黃色,細(xì)胞質(zhì)未染,胞體和突起未顯示。HRP逆標(biāo)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多細(xì)的黑色顆粒,有的可顯示胞體和輪廓,細(xì)胞核不著色(Fig.2C)。HRP/Fos雙標(biāo)神經(jīng)元為黃色胞核的周圍有許多小的黑色顆粒(Fig.2C)。由于Fos和HRP標(biāo)記的部位、形態(tài)和顏色不同,上述各類細(xì)胞在鏡下易區(qū)別。HRP逆標(biāo)神經(jīng)元密集分布于杏仁核的內(nèi)側(cè)亞核(53.68±5.35),中央杏仁核僅見少量逆標(biāo)神經(jīng)元,其他亞核未見HRP陽性神經(jīng)元(Fig.2B),以注射區(qū)同側(cè)為主。HRP/Fos雙標(biāo)神經(jīng)元主要見于內(nèi)側(cè)杏仁核的腹側(cè)部,HRP/Fos雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)為19.24±0.79,占WGA-HRP逆標(biāo)神經(jīng)元總數(shù)的33.55%,占Fos陽性神經(jīng)元細(xì)胞總數(shù)的14.02%。杏仁核在感冒中的作用反應(yīng)性支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性以及氣道重構(gòu)為表現(xiàn)的變態(tài)反應(yīng)性疾病,氣道慢性炎癥、高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)均涉及到神經(jīng)機(jī)制的參與。越來越多的證據(jù)表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與了哮喘發(fā)作。哮喘發(fā)作表現(xiàn)為呼吸功能的改變。杏仁核可以調(diào)節(jié)呼吸的頻率、節(jié)律和幅度的變化。在缺氧的早期(海拔4000～5000米),為了抵抗缺氧引起的釋放率增加,杏仁核主要起抑制作用;在高海拔地區(qū)(7500～8000米),為了抵抗低氧對(duì)神經(jīng)元的抑制,杏仁核對(duì)呼吸主要起興奮作用。Nersesian等刺激貓杏仁復(fù)合體的不同部分,同時(shí)記錄延髓呼吸神經(jīng)元的放電,發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)內(nèi)側(cè)杏仁核能易化和抑制延髓吸氣和呼氣神經(jīng)元的興奮性。那么杏仁核是否參與哮喘發(fā)作呢?我們通過免疫組化染色證實(shí),哮喘發(fā)作時(shí)內(nèi)側(cè)杏仁核和中央杏仁核Fos表達(dá)均增強(qiáng),杏仁核各亞核間存在廣泛的纖維聯(lián)系,提示兩個(gè)亞核可能相互作用共同參與哮喘發(fā)作。Baklavadzhian等認(rèn)為內(nèi)臟感覺器傳到杏仁復(fù)合體的皮質(zhì)內(nèi)側(cè)核和中央核的沖動(dòng)沒有明顯區(qū)別。刺激杏仁核的不同亞核,在延髓的呼吸中樞均能記錄到吸氣神經(jīng)元和呼氣神經(jīng)元的特異性反應(yīng),當(dāng)刺激杏仁復(fù)合體的上述亞核時(shí),發(fā)現(xiàn)支配支氣管的交感神經(jīng)放電沒有明顯區(qū)別,說明在杏仁核內(nèi)沒有確切的交感激活位點(diǎn),也沒有確切的副交感激活位點(diǎn),這進(jìn)一步證實(shí)了我們的觀點(diǎn)。有證據(jù)表明控制氣道的神經(jīng)元參與哮喘發(fā)病機(jī)制,但其具體機(jī)制還不十分清楚。PVN內(nèi)含加壓素(AVP)和催產(chǎn)素(OT)的神經(jīng)元直接投射到氣道相關(guān)的迷走節(jié)前神經(jīng)元,Hadziefendic等向位于大鼠脊髓C8段肺實(shí)質(zhì)注入假狂犬病毒進(jìn)行逆行標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)二級(jí)或三級(jí)神經(jīng)元位于腦干和中腦的PVN和杏仁復(fù)合體等部位。已有研究證實(shí)PVN參與哮喘發(fā)作,哮喘大鼠急性發(fā)作過程中,PVN腦電活動(dòng)增強(qiáng),而電損毀PVN可改善哮喘癥狀,PVN經(jīng)迷走復(fù)合體調(diào)控哮喘發(fā)作。杏仁核是PVN的高級(jí)整合中樞,杏仁核發(fā)出纖維直接投射到PVN。那么哮喘發(fā)作時(shí),這條通路是否活動(dòng)至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Fos免疫組織化學(xué)染色與HRP逆行追蹤技術(shù)相結(jié)合的雙重標(biāo)記方法,可同時(shí)顯示神經(jīng)元的功能活動(dòng)狀態(tài)和傳導(dǎo)通路。將逆行追蹤劑注入PVN后,觀察到杏仁核內(nèi)HRP和Fos雙重標(biāo)記神經(jīng)元主要分布于MeA,證實(shí)MeA可能發(fā)出纖維直接投射到PVN調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)作,而CeA可能主要通過其他途徑影響哮喘發(fā)作。那么MeA到PVN這條通路是如何影響哮喘發(fā)作的呢?哮喘能激活下丘腦-垂體-腎上腺素(HPA)軸,我們的研究發(fā)現(xiàn)哮喘時(shí)大鼠腦內(nèi)OT能神經(jīng)元活動(dòng)也增強(qiáng),而MeA是杏仁復(fù)合體內(nèi)調(diào)控HPA軸和OT對(duì)非條件性情感應(yīng)激的主要位點(diǎn),刺激MeA亦能引起HPA軸活動(dòng)。Tanaka等證實(shí)MeA的神經(jīng)元投射到PVN,可能直接參與調(diào)節(jié)PVN內(nèi)的神經(jīng)分泌作用,如促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRF)和AVP的釋放。杏仁核亦影響OT細(xì)胞的活動(dòng),損毀MeA(而不是CeA)能阻斷應(yīng)激引起的視上核(SON)和PVN內(nèi)OT神經(jīng)元的活動(dòng)。我們推測內(nèi)側(cè)杏仁核通過PVN參與哮喘發(fā)作的作用可能涉及MeA對(duì)HPA軸和PVN內(nèi)OT能神經(jīng)元的直接調(diào)控。杏仁核亦是產(chǎn)生情緒及應(yīng)激的關(guān)鍵部位,而哮喘發(fā)作時(shí)多伴有負(fù)面情緒反應(yīng)。哮喘時(shí),杏仁核內(nèi)Fos蛋白表達(dá)增加可能與其對(duì)情緒的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。過去認(rèn)為杏仁復(fù)合體的各亞核都對(duì)情感行為發(fā)揮一定作用,但近年來有人用Fos作為標(biāo)記物研究表明,情感應(yīng)激時(shí)活動(dòng)最明顯的核團(tuán)是MeA。情感應(yīng)激引起的c-fos表達(dá)更恒定地出現(xiàn)在內(nèi)側(cè)杏仁核,而不是其他杏仁核,包括中央杏仁核。中央杏仁核主要參與生理應(yīng)激。哮喘發(fā)作時(shí)內(nèi)側(cè)杏仁核和中央杏仁核Fos蛋白表達(dá)均增強(qiáng),提示哮喘發(fā)作過程中可能既有生理應(yīng)激又有心理應(yīng)激的參與。大量證據(jù)表明哮喘與免疫反應(yīng)有關(guān)。杏仁核屬于邊緣系統(tǒng)的一部分,杏仁核可調(diào)節(jié)免疫功能,杏仁核