基因工程與基因敲除

(geneticrecombination

andgeneticengineering)基因重組是指在體外用酶學方法將不同來源的DNA進行切割、連接，組成一個新的DNA分子的過程，又稱DNA重組?；蚩寺?/p>

將重組DNA分子導入到合適的受體細胞中，使其擴增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ棠康模孩俜蛛x獲得某一目的基因或DNA②獲得目的基因的表達產物（蛋白質）基因工程實現基因重組和基因克隆所采用的方法和相關工作，統稱為重組DNA技術或基因工程。重組DNA技術的基本流程目的基因的獲??；克隆載體的選擇和處理外源基因與載體的連接重組DNA導入受體菌重組體的篩選

本節主要內容

一、重要的工具酶二、基因克隆常用的載體

三、重組DNA基本原理四、重組技術在醫學和制藥工業中的應用

五、基因工程制備敲除鼠文獻解析一、重要的工具酶工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉錄等有關的各種酶系統。工具酶

限制性核酸內切酶

DNA聚合酶逆轉錄酶

DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶（一）限制性核酸內切酶(RE)

是一類由細菌產生的能專一識別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點磷酸二酯鍵的核酸內切酶，簡稱限制酶或切割酶。

根據限制酶的作用特性，一般分為三類：

——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

限制酶（Ⅱ型）識別及切割位點特異識別及切割48個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產生3種缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉對稱;

粘性末端是指經內切酶特異切割后產生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的堿基序列相互具有互補性。⑴產生5'-粘性末端

⑵產生3'-粘性末端⑶產生平頭末端/鈍端其它特殊性質的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶同裂酶

又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產生平頭末端，稱為同識同切；切割點也可以是不同的，產生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識異切。同裂酶——同識同切同裂酶——同識異切同尾酶

同尾酶

識別DNA分子中不同核苷酸序列，作用后產生相同的粘性末端。可變酶可變酶

識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。如，BstpⅠ，其識別順序為GGTNACC。（二）DNA聚合酶（DNApolymerase)

（最常用的DNA聚合酶有以下4種）

1.DNA聚合酶Ⅰ2.DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段

3.TaqDNA聚合酶

4.T4噬菌體DNA聚合酶1.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）

E.Coli

DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一個具有3種酶活性的多功能性酶。包括：

5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性

5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移DNApolⅠ應用⑴催化DNA缺口平移反應，制備高比活性DNA探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對DNA3’突出末端進行標記；⑷DNA序列分析。2.Klenow片段（DNApol.大片斷）Klenow片段用途⑴補齊雙鏈DNA的

3ˊ末端；⑵用標記堿基補齊3ˊ末端；

⑶在cDNA克隆中，用于第二股鏈的合成；⑷

DNA序列分析。3.TaqDNApol（耐熱DNA聚合酶）

作用特點1）TaqDNApol催化DNA合成的最適溫度范圍

70

75℃，2）95℃以上高溫，半小時不失活，3）最適合用于聚合酶鏈反應（PCR）。（三）逆轉錄酶⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈⑵水解RNA：DNA雜交鏈中的RNA⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。

特點一個多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：

逆轉錄酶的應用：⑴將mRNA逆轉錄成cDNA，構建cDNA文庫；⑵補平和標記5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制備雜交探針等。（四）DNA連接酶(DNAligase)

DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3ˊ－OH與另一條鏈的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構成一條完整的DNA長鏈。

DNA連接酶的用途（1）兩個雙鏈DNA片段連接起來5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA連接酶

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修補帶有缺口的雙鏈DNA分子T4DNA連接酶（五）堿性磷酸酶

堿性磷酸酶(BAP)能夠催化水解去除DNA或RNA5'-端的磷酸基團。用途⒈制備載體時，去除載體分子5ˊ－端磷酸基后，可防止載體自身環化連接，提高重組效率。⒉用32P標記5'-端前，去除5'-P，再通過激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端進行標記。（六）末端（脫氧核苷酸）轉移酶(TdT)

作用將dNTP加到DNA的3’-OH末端；也可催化載體分子或待克隆的DNA片斷上加上互補的同聚尾，便于進一步連接。應用①探針標記

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進行連接重要的工具酶工具酶

活性限制性核酸內切酶

識別特異序列，切割DNADNA聚合酶

以DNA為模板合成DNA逆轉錄酶

以RNA為模板合成DNAT4DNA連接酶

催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵堿性磷酸酶

切除末端磷酸末端轉移酶

催化3'-端合成同聚體尾二、基因克隆常用的載體載體(vector)

是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細胞的運載工具，其化學本質為DNA。

主要內容載體必須具備的基本條件載體的種類常用的載體（一）載體必須具備的基本條件⒈有自身的復制子，能獨立復制⒉具備多個限制酶的識別位點(多克隆位點)⒊具有遺傳表型或篩選標記⒋有足夠的容量以容納外源DNA片段。⒌表達型載體還應具備與宿主細胞相適應的啟動子、前導序列、增強子等調控元件。（二）載體的種類1.克隆載體

用來克隆和擴增DNA片段的載體，具有3點共性：⑴能夠在受體細胞復制；⑵帶有藥物抗性基因，便于篩選；⑶可導入受體細胞。2.表達載體除具有克隆載體所具有的性質外，還帶有表達構件——轉錄和翻譯所必須的DNA順序。（三）常用的載體

1.質粒(plasmid)：

是存在于細菌染色體外的、能自主復制的雙鏈環狀DNA分子。

作為克隆載體的質粒應具備以下特點：

①

分子量相對較小，能穩定存在于細菌體內

②

具有1個以上的遺傳標志，便于篩選

③

具有多克隆位點

常用的質粒：pBR322質粒、pUC系列等

pBR322質粒①4363bp②含一個復制點(ori)含一個抗氨卞青霉素標記(ampR)④一個抗四環素標記(tetR)⑤ampR和tetR基因內各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入

pUC系列質粒

由pBR322和M13噬菌體構建而成的雙鏈質粒載體；（1）2674bp；（2）有ampr和與M13噬菌體相同的多克隆位點（MCS）（3）有一個來自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷,編碼半乳糖苷酶2.λ噬菌體

組成特點：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含65個基因，在其分子兩端各含有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點。

λ噬菌體感染細菌后的溶菌性生長和溶源性生長

溶菌性生長噬菌體感染細菌后，2個COS位點互補成環，在宿主菌體內連續復制，合成大量基因產物，進而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來的噬菌體又可感染其他細菌。

溶源性生長

噬菌體感染細菌后，可將自身DNA整合到細菌的染色體中去，與之一起復制，并遺傳給子代細胞，宿主細胞不被裂解。

λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）

三、重組DNA基本原理

（DNA重組基本程序包括下列過程）

分—獲取目的基因和載體接—目的基因與載體的連接轉—重組DNA導入宿主細胞篩—重組DNA的篩選與鑒定(一)目的基因的獲?。ǚ郑┠康幕蚴侵杆芯炕驊玫幕?，也是需要克隆或表達的基因。

目的基因來源

1.制備基因組DNA2.制備cDNA3.聚合酶鏈式反應

4.人工合成基因1.基因組DNA(基因文庫)限制性內切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝2.制備cDNA

分離目的基因的mRNA逆轉錄生成cDNA單鏈水解去除mRNA，合成cDNA雙鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA導入宿主細胞克隆,構建cDNA文庫3.聚合酶鏈反應(PCR)

在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個步驟的反復多次循環（2530次），擴增目的基因。

4.化學合成法較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測序引物定點突變核酸雜交探針(二)目的基因與載體的連接（接）

（主要有以下4種連接方式）

1.粘性末端連接

2.平頭末端連接

3.人工接頭法

4.同源多聚尾連接法

1.粘性末端連接

將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構成重組DNA分子。2.

平頭末端連接

在T4DNA連接酶的作用下將平頭末端的目的基因與載體DNA連接起來。3.人工接頭法合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割，產生粘性末端→連接，構建重組DNA。4同源多聚尾連接法

轉化

以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程；轉染

以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程；轉導

以噬菌體作載體構建的重組體導入受體細胞的過程。

感受態細胞

用特殊方法處理后，受體細胞才具備接受外源DNA的能力，這種細胞稱感受態細胞。感受態細胞有原核細胞和真核細胞兩大類。(三)重組DNA導入宿主細胞（轉）

（四）重組DNA的篩選與鑒定（篩）（篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法）

1）平板篩選

2）限制酶切圖譜篩選

3）PCR篩選重組體