兩株鏈霉菌r1、r2復(fù)合微生物肥料對幾種真菌的影響

微生物肥料是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的肥料。隨著不必要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，微生物肥料變得越來越易用作不可替代的優(yōu)勢。陳育如等應(yīng)用多種功能菌株混合發(fā)酵和添加具有解磷、解鉀、分泌植物生長刺激性物質(zhì)的功能微生物配制了兩種復(fù)合性微生物肥料(簡稱菌肥)。為了明確其防病效果,本試驗采用室內(nèi)抑菌試驗和苗期人工接種方法,研究了兩種菌肥對植物主要土傳病原菌的抑制效果。1材料和方法1.1streptomycesp.涇陽鏈霉菌(Streptomycesjingyangensis)R-1為南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物資源實驗室保存菌種,R-2(Streptomycessp.)由本室分離自南京郊區(qū)菜田;植物病原真菌草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticilliumalbo-atrum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和R-1、R-2分別與有機肥配制的一號菌肥、二號菌肥均由南京師范大學(xué)微生物資源實驗室提供。1.2抑菌圈直徑測定將菌株R-1、R-2在高氏2號液體培養(yǎng)基上31℃搖瓶培養(yǎng)7d,3500r/min離心15min,取上清液經(jīng)無菌濾器制成無菌濾液。用紙片法測定對棉花枯萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑。每個病原菌10皿,每皿4片,以沾取無菌水為對照,每處理5次重復(fù)。將菌株R-1、R-2搖瓶培養(yǎng)后于121℃、20min高壓滅菌制成滅菌過濾液涂布在馬鈴薯蛋白胨培養(yǎng)基上,用平板涂布法測定對4種病原真菌的抑菌作用。以不涂布滅菌過濾液而接種病原菌為對照,每處理5個重復(fù)。1.3過濾液添加量的確定兩種烘干菌肥與水(1∶10重量比)按1.2方法分別制成無菌過濾液、滅菌過濾液,兩菌株滅菌過濾液按1∶10稀釋;將6種過濾液分別與棉花枯萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花黃萎病菌孢子懸液混合(每視野30～60個孢子),滴在載玻片上,放入培養(yǎng)皿中,置28℃恒溫箱中培養(yǎng)。設(shè)無菌水孢子懸液為對照。每隔1h用顯微鏡觀察病原菌孢子的萌發(fā)情況,4h后計算病原菌孢子的萌發(fā)率。1.4土壤和菌肥的滲透將一號菌肥、二號菌肥及其各自與土壤的混合物(1∶3)分別裝入深容器中加入適量無菌水混勻,表面做平放入滅菌濾紙,使其與下層物質(zhì)緊密接觸,在濾紙上倒入滅菌水瓊脂,放入4℃冰箱中24h。待土壤和菌肥中的活性物質(zhì)滲透至水瓊脂后,用打孔器打片后移于載玻片上置培養(yǎng)皿中。在濕室環(huán)境下滴入棉花枯萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花黃萎病菌孢子懸液,每視野30～60個孢子。每處理3次重復(fù),設(shè)純土壤和無滲透瓊脂片為對照。每隔1h觀察其孢子的萌發(fā)情況,4h后計算病原菌孢子的萌發(fā)率。1.5苗期的人工接種試驗和抗病性試驗1.5.1種苗、病毒、種棉花種子(泗棉3號)用清水浸泡24h,發(fā)芽后播種于滅菌土壤中。真葉展開期拔出棉苗浸入棉花黃萎病原菌的孢子懸液(3×106/ml)中15min,移植于兩種菌肥土壤的小花盆中,每盆5株,以滅菌土壤為對照。每處理5盆。當(dāng)接種在滅菌土壤中的棉花苗開始萎蔫時調(diào)查發(fā)病率,共調(diào)查3次,間隔5d。1.5.2馬鈴薯種子的處理馬鈴薯切成1cm×1cm方塊置三角瓶中高溫高壓滅菌后接種油菜菌核病菌,28℃溫箱中培養(yǎng)7d,取出已長滿菌絲的馬鈴薯塊,埋入兩種菌肥土壤的小花盆中(土下2cm處)培養(yǎng)。以滅菌土壤為對照,每處理3盆。15d后播種油菜種子(四月慢),種子表面經(jīng)1%次氯酸鈉消毒,每盆播種15粒。7d后調(diào)查發(fā)病率。2結(jié)果與分析2.1不同植物病原菌抑菌圈直徑比較紙片法測定結(jié)果(表1)表明,兩菌株無菌過濾液對3種植物病原菌均有不同程度的抑制作用。R-1、R-2二者間差異不顯著,但均表現(xiàn)為對草莓灰霉病菌的抑菌圈直徑最大。平板涂布法結(jié)果(表2)表明,R-1、R-2發(fā)酵液的代謝物質(zhì)明顯抑制4種植物病原菌的生長。植物病原菌對照皿中5～7d菌落即可長滿,而添加抑菌物質(zhì)的各皿均生長緩慢,添加R-2的平皿中棉花黃萎病菌菌落幾乎沒有生長。2.2對病原菌的芽孢桿菌孢子萌發(fā)的影響兩種肥料的無菌和滅菌過濾液及兩菌株滅菌過濾液均對植物病原菌孢子的萌發(fā)有影響(圖1)。其中二號肥的無菌過濾液對病原菌的孢子萌發(fā)抑制效果最好,對草莓灰霉病菌、棉花黃萎病菌、棉花枯萎病菌的孢子萌發(fā)抑制率分別是69%、50%、42%;二號肥的滅菌過濾液效果次之,但比其它處理效果好。2.3使用抗菌肥,抑制率高從圖2可知,在模擬土壤環(huán)境中土壤和菌肥溶出到水瓊脂的活性物質(zhì)對草莓灰霉病原菌孢子的萌發(fā)明顯抑制,抑制率均在86%以上,二號肥與土壤混合物抑制率達(dá)到了98%;而棉花黃萎病菌和棉花枯萎病菌僅在添加菌株R-2的二號肥和二號肥與土壤混合的環(huán)境下孢子萌發(fā)才受到明顯抑制,抑制率分別達(dá)67%、58%和74%、64%。2.4黃渙病和從油菌核病防治效果試驗結(jié)果表明,一號肥和二號肥對棉花黃萎病和油菜菌核病均有不同程度的抑制效果,一號肥分別為28%、41.9%,二號肥分別為72%、97.2%。3對微生物肥料的認(rèn)識本試驗中,菌肥滅菌過濾液和無菌過濾液均對病原菌的孢子萌發(fā)有影響,但無菌過濾液效果更好。這意味著耐高溫的和不耐高溫的不同活性代謝物質(zhì)都在微生物肥料中存在。在模擬土壤環(huán)境和苗期人工接種試驗中,由于有不確定的土壤物質(zhì)存在,更接近自然的農(nóng)業(yè)施肥環(huán)境,結(jié)果與兩種微生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用示范效果接近(待