五靈脂的薄層色譜鑒別研究

第五靈脂是指老鼠科的復齒動物。它是山西省和河北省的一種干燥大便。性溫,味咸、甘,歸肝經,有活血化瘀止痛之功效。2005年版中國藥典中有13個復方制劑含有五靈脂。但由于五靈脂藥材藥用部位的特殊性,導致其來源不規范,市場上藥材質量參差不齊,而目前尚無有效的質量控制方法。中國藥典中僅1990年版收載其性狀鑒別,亦有文獻報道了其顯微和熒光鑒別,但未有薄層色譜鑒別方法的報道。本文首次報道以五靈脂中的主要成分扁柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮為指標,建立五靈脂藥材的薄層色譜鑒別方法,為其進一步的質量控制提供依據。1試劑和藥品ZF-I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠),RE52CS型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠),Bruker-ARX-300和600型核磁共振儀(TMS內標),Simadzu高效液相色譜儀(LC-10Atvp泵,DAD檢測器,Class-vp工作站,日本島津公司)。D101大孔樹脂(購自天津市海光化工有限公司),柱層析硅膠(60～100目和100～200目)由青島海洋化工廠分廠生產,柱層析聚酰胺(30～60目和100～200目)及聚酰胺薄膜由浙江臺州路橋四甲生化塑料廠生產,溶劑為AR級。五靈脂對照藥材購自中國藥品生物制品檢定所(批號:121348-200501)。五靈脂藥材購自山西、河北、陜西等地,由遼寧省藥品檢驗所王維寧副主任藥師鑒定為鼯鼠科動物復齒鼯鼠TrogopterusxanthipesMilne-Edwars的干燥糞便,1～7批為正品復齒鼯鼠的干燥糞便,第8批為偽品鼠兔類糞便。2方法和結果2.1洗脫溶劑和色譜取藥材1.25kg,加8倍量乙醇回流提取3次,每次1.5h,濾過,合并濾液,減壓回收乙醇,得總浸膏120g。經大孔樹脂柱色譜,分別用10%、70%、90%乙醇洗脫,回收溶劑得浸膏分別為58、22、40g。90%乙醇洗脫部分再經硅膠柱色譜,以二氯甲烷-丙酮梯度洗脫。二氯甲烷-丙酮(100∶20)與(100∶30)洗脫部分經聚酰胺柱色譜,采用二氯甲烷-甲醇(4∶1～1∶1)系統進行洗脫,經反復重結晶得扁柏雙黃酮(I)(4.2mg)和穗花杉雙黃酮(Ⅱ)(5.7mg)。經薄層色譜法和HPLC面積歸一化法試驗,純度均達到95%以上,符合鑒別用對照品要求。2.2中間體5位羥基化合物,c-4e,d化合物Ⅰ:淡黃色粉末。Mg-HCl反應陽性,Molish反應陰性,提示該化合物為黃酮苷元。1H-NMR譜中,δ13.21(1H,s)和12.89(1H,s)分別為兩個黃酮5位羥基締合質子信號,提示該化合物為雙黃酮類。8.03(2H,d,J=8.9Hz),7.04(2H,d,J=8.9Hz)和7.99(2H,d,J=8.9Hz),6.95(2H,d,J=8.9Hz)為兩組典型的AA′BB′偶合系統質子信號,推測雙黃酮的兩個4′位均被取代。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:13.21(1H,s,OH-5″),12.89(1H,s,OH-5),11.30(1H,s,OH-4″),10.86(1H,s,OH-7″),10.40(1H,s,OH-7),8.03(2H,d,J=8.9Hz,H-2′,6′),7.04(2H,d,J=8.9Hz,H-3′,5′),7.99(2H,d,J=8.9Hz,H-2ue087,6ue087),6.95(2H,d,J=8.9Hz,H-3ue087,5ue087),6.87(2H,s,H-3,H-3″),6.50(1H,d,J=1.5Hz,H-8),6.21(1H,d,J=1.5Hz,H-6),6.74(1H,s,H-8″);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:164.3(C-2),103.9(C-3),181.7(C-4),161.5(C-5),98.9(C-6),163.2(C-7),94.1(C-8),157.2(C-9),103.9(C-10),124.3(C-1′),128.4(C-2′,6′),115.4(C-3′,5′),161.5(C-4′),164.2(C-2″),102.7(C-3″),182.2(C-4″),153.2(C-5″),124.3(C-6″),157.4(C-7″),94.7(C-8″),153.8(C-9″),104.0(C-10″),121.1(C-1ue087),128.7(C-2ue087,6ue087),116.1(C-3ue087,5ue087),160.7(C-4ue087)。該化合物的1H-NMR和13C-NMR數據與文獻報道的扁柏雙黃酮(hinokiflavone)數據一致,故鑒定該化合物為扁柏雙黃酮。化合物Ⅱ:黃色粉末。Mg-HCl反應陽性,Molish反應陰性,提示該化合物為黃酮苷元。1H-NMR譜中,δ13.10(1H,s)和12.96(1H,s)分別為兩個黃酮5位羥基締合質子信號,提示該化合物亦為雙黃酮類。δ7.56(2H,d,J=8.8Hz)和6.71(2H,d,J=8.8Hz)為典型的AA′BB′偶合系統質子信號。δ7.13(1H,d,J=9.3Hz),8.01,7.99(2H,m.)為ABX偶合系統質子信號。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:13.10(1H,s,OH-5′),12.96(1H,s,OH-5),10.78(1H,s,OH-7″),10.24(1H,s,OH-7),8.01,7.99(2H,m,H-2′,H-6′),7.13(1H,d,J=9.3Hz,H-5′),7.56(2H,d,J=8.8Hz,H-2ue087,6ue087),6.71(2H,d,J=8.8Hz,H-3ue087,5ue087),6.45(1H,d,J=1.9Hz,H-8),6.18(1H,d,J=1.9Hz,H-6),6.39(1H,s,H-6″),6.83(1H,s,H-3),6.78(1H,s,H-3″);13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:163.8(C-2),103.0(C-3),181.8(C-4),162.0(C-5),98.9(C-6),164.2(C-7),94.1(C-8),157.4(C-9),103.7(C-10),121.0(C-1′),127.9(C-2′),120.1(C-3′),159.7(C-4′),116.3(C-5′),131.5(C-6′),163.9(C-2″),102.7(C-3″),182.2(C-4″),161.1(C-5″),98.7(C-6″),160.6(C-7″),104.1(C-8″),154.6(C-9″),103.8(C-10″),121.5(C-1ue087),128.3(C-2,6ue087),115.8(C-3ue087,5ue087),161.5(C-4ue087)。該化合物的1H-NMR和13C-NMR數據與文獻報道的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)的數據一致,故鑒定該化合物為穗花杉雙黃酮。2.3膜層析成像2.3.1對照溶液的制備分別精密稱取扁柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮對照品各1mg,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。2.3.2對照藥材溶液的制備精密稱取五靈脂對照藥材粉末1.0g,80%乙醇50mL回流提取2h,冷卻,濾過,濾液濃縮至10mL,乙酸乙酯萃取3次(20、10、10mL),合并萃取液,蒸干,加甲醇1mL使溶解,作為對照藥材溶液。2.3.3樣品溶液的制備五靈脂藥材供試品溶液按照“2.3.2”項下方法制備。2.3.4靈脂對照藥材的晚品質取對照藥材及供試品溶液10μL,對照品溶液5μL,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以二氯甲烷-甲醇-冰乙酸(5∶2∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以1%三氯化鋁乙醇溶液,加熱至斑點清晰,紫外燈254nm下檢視,結果見圖1。圖1顯示,五靈脂對照藥材S3及1～7批正品中在與扁柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮相同的位置顯示相同顏色的斑點,而第8批偽品藥材斑點則明顯不同。色譜圖斑點清晰,色譜行為明顯,適用于五靈脂藥材的鑒別。3討論3.1復齒鼠的食料條件在前期的植化工作中,筆者發現五靈脂的黃酮類成分含量較高。其中尤以扁柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮最高。其原因可能與復齒鼯鼠的食料有關。有文獻報道,復齒鼯鼠主要以側柏枝葉、籽實、油松等植物為食。亦有文獻記載側柏葉中含扁柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮。3.2雙黃酮類化合物的提取采用乙醇和乙酸乙酯兩種溶劑進行比較:連續回流1h;超聲30min。實驗表明乙醇和乙酸乙酯兩種溶劑回流和超聲方法均能提取出雙黃酮類化合物,但均不能排除葉綠素的干擾,因此采用回流提取后乙酸乙酯萃取法。實驗表明80%以上濃度乙醇能提取