柴胡加龍骨牡蠣湯快速抗抑郁作用及機(jī)制研究目的確立《傷寒論》經(jīng)典方劑柴胡加龍骨牡蠣湯的快速抗抑郁作用及機(jī)制。通過(guò)對(duì)不同劑量柴胡加龍骨牡蠣湯快速抗抑郁作用的篩發(fā)掘該方劑快速抗抑郁的最優(yōu)劑量通過(guò)拆方研究發(fā)掘其快速抗抑郁的核心組建立嗅球摘除抑郁模型評(píng)估該抑郁模型的抑郁行為學(xué)及前額葉谷氨酸受體機(jī)制。證明柴胡加龍骨牡蠣湯通過(guò)調(diào)節(jié)前額葉AMM氨酸受體機(jī)制及胞內(nèi)AKT-路改善神經(jīng)突觸可塑性產(chǎn)生快速抗抑郁作用。戊巴比妥睡眠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)評(píng)估柴胡加龍骨牡蠣湯的鎮(zhèn)靜促眠作用。并進(jìn)一步通過(guò)臨床觀察確立該方的快速抗抑郁及促眠作用。方法、以漢代兩=臨床標(biāo)準(zhǔn)以及人與小鼠的用藥換算關(guān)系分別以柴胡加龍骨牡蠣湯臨床常規(guī)劑量,3劑量,2劑量及1/4量分為10g/kg,7.5以及kg,5g/kg2.5g/kg量組。首先對(duì)10g/kg,7.5三個(gè)劑量組在Bal品系正常小鼠上篩查其抗抑郁樣作用。在單次給藥柴胡加龍骨牡蠣湯2小時(shí)后進(jìn)行抗抑郁行為學(xué)篩查實(shí)驗(yàn)。即開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)測(cè)試懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間測(cè)試及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)篩選出最佳抗抑郁劑量再以此劑量進(jìn)行藥物的起效時(shí)間與作用持久性實(shí)驗(yàn)。分別在單次給藥后3分鐘,小時(shí),時(shí),時(shí)及9小時(shí)分別行懸尾測(cè)試陌生環(huán)境攝食測(cè)試等行為學(xué)篩查確定柴胡加龍骨牡蠣湯快速抗抑郁的最佳有效劑量及持久性同樣地方法對(duì)7.5g/k5g/k量組在昆明品系小鼠上通過(guò)單次給藥后2小時(shí)的自主活動(dòng)懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間測(cè)試及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)篩查發(fā)揮快速抗抑郁作用的最小劑量。然后在該最小劑量條件下給藥后3分鐘,小時(shí),時(shí),時(shí)及9小時(shí)分別行懸尾測(cè)試陌生環(huán)境攝食測(cè)試實(shí)驗(yàn)檢測(cè)柴胡加龍骨牡蠣湯快速起效的時(shí)間及作用持久性。2將柴胡加龍骨牡蠣湯按照不同方藥組分的治則治法進(jìn)行拆方實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分為空白對(duì)照組柴胡加龍骨牡蠣湯全方組小柴胡湯組桂枝茯苓等大黃龍骨牡蠣組小柴胡湯加龍骨牡蠣組以及小柴胡湯加桂枝茯苓大黃組六個(gè)實(shí)驗(yàn)組別。在各組單次給藥的3分鐘,時(shí),時(shí)及7小時(shí)進(jìn)行懸尾不動(dòng)時(shí)間測(cè)試開(kāi)場(chǎng)行為測(cè)試強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間測(cè)試以及陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)篩查各實(shí)驗(yàn)組在不同時(shí)間點(diǎn)的抗抑郁樣作用以及柴胡加龍骨牡蠣湯發(fā)揮快速抗抑郁作用的核心組成部分。3.照文獻(xiàn)報(bào)道方法及小鼠腦立體定向手冊(cè)建立嗅球摘除抑郁模型。將小鼠分為空白對(duì)照組假手術(shù)組、嗅球摘除模型組。運(yùn)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)懸尾實(shí)驗(yàn)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)估模型的抑郁行為。然后結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果以柴胡加龍骨牡蠣湯全方及快速抗抑郁的核心藥物組對(duì)嗅球摘除模型小鼠單次灌胃給藥并分別參以陰性對(duì)照生理鹽水灌胃、陽(yáng)性對(duì)照氯胺酮30mg腹腔注射干預(yù)措施。在完成上述藥物處理后2小鼠、4小時(shí)及7小時(shí)后進(jìn)行開(kāi)場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)、懸尾絕望實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步重復(fù)評(píng)估柴胡加龍骨牡蠣湯全方以及其核心抗抑郁組分在嗅球摘除模型中的抗抑郁作用。根據(jù)篩查結(jié)果對(duì)在模型上能發(fā)揮快速抗抑郁作用的方藥進(jìn)一步行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確立柴胡加龍骨牡蠣湯在嗅球摘除模型小鼠上發(fā)揮快速抗抑郁作用的組分。4分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基于實(shí)驗(yàn)的結(jié)果給與嗅球摘除抑郁模型小鼠快速抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)藥物2小時(shí)后犧牲小鼠斷頭取腦海馬及前額葉組織。提取蛋白行Western驗(yàn)檢測(cè)前額葉AM體亞型GluR1受體亞型NNR、NR的變化對(duì)前額葉AKT-信號(hào)通路的影響以及海馬區(qū)BD、Gl的表達(dá)變化。5.巴比妥鈉睡眠誘導(dǎo)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)以空白小鼠為研究對(duì)象參照實(shí)驗(yàn)1-3的結(jié)果分為戊巴比妥睡眠誘導(dǎo)組柴胡加龍骨牡蠣湯(5g巴比妥組以及柴胡加龍骨牡蠣湯(1Og聯(lián)合戊巴比妥組分別在柴胡加龍骨牡蠣湯單次給藥及重復(fù)天給藥條件下行戊巴比妥睡眠誘導(dǎo)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)戊巴比妥誘導(dǎo)采取腹腔注射給藥形式以引起小鼠扶正反射剛好不消失的最大劑量為閾下劑量以剛好能引起小鼠入睡的最小劑量為閾上劑量柴胡加龍骨牡蠣湯于戊巴比妥給藥前3分鐘灌胃。首先觀察柴胡加龍骨牡蠣湯單次給藥、戊巴比妥鈉閾下劑量誘導(dǎo)下柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)小鼠入睡率的影響然后在戊巴比妥鈉閾上劑量誘導(dǎo)下觀察柴胡加龍骨牡蠣湯單次給藥對(duì)小鼠睡眠時(shí)間及入睡潛伏期的影響按照同樣的實(shí)驗(yàn)方法在柴胡加龍骨牡蠣湯重復(fù)給藥天的最后一次給藥后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)觀察多次給藥對(duì)小鼠入睡率、睡眠潛伏期及睡眠時(shí)間的影響。6.床觀察研究在臨床住院患者中篩選重度單向抑郁癥伴失眠患者分為SS氮卓類促眠藥西藥治療組以及柴胡加龍骨牡蠣湯加上述同類西藥治療組所有苯二氮卓類藥物及新型促眠藥均以地西泮等效劑量換算最終換算為地西泮劑量在試驗(yàn)的第1,24HA表評(píng)估比較兩組之間在遲滯因子、焦慮軀體化因子及睡眠因子從改善情況以及第1進(jìn)行PS表評(píng)估,進(jìn)一步評(píng)估柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)失眠的作用并且評(píng)估兩治療組對(duì)促眠西藥用量的影響。結(jié)果:胡加龍骨牡蠣湯1Og/kg,7.5三個(gè)用藥劑量在lb/c品系小鼠上單次給藥2小時(shí)后對(duì)小鼠開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)無(wú)明顯影響僅5gg組能夠降低小鼠懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間三個(gè)劑量組對(duì)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均沒(méi)有明顯影響柴胡加龍骨牡蠣湯(5g藥3分鐘,小時(shí),時(shí)后均能夠明顯降低小鼠懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間結(jié)果與氯胺酮相似而在給藥9小時(shí)后僅氯胺酮降低了懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間。在4小時(shí)的陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)中柴胡加龍骨牡蠣湯及氯胺酮均明顯降低了小鼠攝食潛伏期提高了小鼠的攝食量。柴胡加龍骨牡蠣湯1Og/kg,5g/三個(gè)劑量在昆明品系小鼠上單次給藥2小時(shí)后對(duì)小鼠開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)無(wú)明顯影響;5g組能夠明顯降低懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間;1O僅能降低強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。在給藥4小時(shí)的陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)中柴胡加龍骨牡蠣湯10g/kg5g/kg量組均能夠降低小鼠攝食潛伏期但10g組的小鼠攝食量降低繼續(xù)以柴胡加龍骨牡蠣湯5g進(jìn)行藥效的快速及持久性測(cè)試發(fā)現(xiàn)在柴胡加龍骨牡蠣湯(5g藥后3分鐘,小時(shí),時(shí)均能夠明顯降低小鼠懸尾測(cè)試不動(dòng)時(shí)間結(jié)果與氯胺酮相似。2.胡加龍骨牡蠣湯全方及拆方各實(shí)驗(yàn)組在單次給藥3分鐘及4小時(shí)后,僅全方組及小柴胡湯組能夠明顯降低懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間給藥后2小時(shí)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中柴胡加龍骨牡蠣湯全方組、小柴胡湯組及小柴胡加桂枝茯苓大黃組均能降低小鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間而桂枝茯苓大黃龍骨牡蠣對(duì)強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間沒(méi)有明顯影響在給藥后第7小時(shí)的陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)中僅柴胡加龍骨牡蠣湯全方小柴胡加龍骨牡蠣小柴胡加桂枝茯苓大黃三個(gè)組降低了小鼠的攝食潛伏期而小柴胡湯組及桂枝茯苓大黃龍骨牡蠣組對(duì)攝食潛伏期沒(méi)有明顯影響。3.空白組及假手術(shù)組比較模型組小鼠的糖水偏好自嗅球摘除術(shù)后周開(kāi)始明顯下降術(shù)后的第1的糖水偏好值均低于空白對(duì)照組直至術(shù)后第四周恢復(fù)正常。與空白對(duì)照組相比嗅球摘除模型小鼠在開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)行為學(xué)上表現(xiàn)出活動(dòng)的總路程增多在分別給與柴胡加龍骨牡蠣湯全方及小柴胡湯處理后的2小時(shí),時(shí)及7小時(shí)行開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)懸尾實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn)中柴胡加龍骨牡蠣湯全方、小柴胡湯對(duì)小鼠的開(kāi)場(chǎng)自主活動(dòng)無(wú)明顯影響但小柴胡湯組降低了小鼠的中央活動(dòng)時(shí)間僅柴胡加龍骨牡蠣湯全方實(shí)驗(yàn)組在單次給藥2小時(shí)、72小時(shí)后能夠降低小鼠懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間并且在4小時(shí)的糖水偏好測(cè)試中明顯提高了小鼠的糖水偏好百分比作用與氯胺酮相似。進(jìn)一步的行為學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)柴胡加龍骨牡蠣湯在嗅球摘除抑郁模型小鼠上單次給藥2小時(shí)后降低小鼠的懸尾絕望不動(dòng)時(shí)間作用持續(xù)至7小時(shí)并且在48小時(shí)的糖水偏好及陌生環(huán)境攝食實(shí)驗(yàn)中柴胡加龍骨牡蠣湯能夠提高小鼠的糖水偏好比值降低攝食潛伏期增加攝食量結(jié)果與氯胺酮相似。4與空白對(duì)照組相比嗅球摘除抑郁模型小鼠的前額葉谷氨酸AM體亞型Gl明顯降低,而NM體亞型NNR、AR達(dá)上調(diào)并且嗅球摘除模型小鼠明顯抑制了胞內(nèi)AKT-及信號(hào)通路柴胡加龍骨牡蠣湯能夠降低模型小鼠前額葉NNR、NR的表達(dá)提高GluR1達(dá)從而提高AMPAR/NMDAR同時(shí)能夠提高AKT-磷及下游Gl達(dá)水平。我們還發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比嗅球摘除抑郁模型小鼠的海馬腦區(qū),Gl、R1BD白水平升高柴胡加龍骨牡蠣湯能夠進(jìn)一步提高海馬區(qū)Gl達(dá)而對(duì)BD平無(wú)明顯影響結(jié)果與氯胺酮相似5.胡加龍骨牡蠣湯(10g/kg)給藥條件下能夠延長(zhǎng)小鼠的睡眠時(shí)間并且有降低入睡潛伏期的趨勢(shì)重復(fù)給藥天后能夠提高小鼠的入睡率降低小鼠的睡眠潛伏期并且有延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的趨勢(shì)。6在單向重度抑郁癥伴失眠患者中柴胡加龍骨牡蠣湯聯(lián)合西藥治療組在治療1時(shí)HA分與對(duì)照組無(wú)顯著性差異但在遲滯因子睡眠障礙因子評(píng)分是均較對(duì)照組明顯下降進(jìn)一步的PS眠量表評(píng)定顯示柴胡加龍骨牡蠣湯聯(lián)合治療組在PS評(píng)分以及入睡時(shí)間、睡眠效率、日間功能障礙、催眠藥物四個(gè)因子方面具有顯著得改善在輔助治療藥物方面柴胡加龍骨牡蠣湯聯(lián)合西藥治療組新型促眠藥的等效地西泮應(yīng)用劑量為3.6新型促眠藥的等效地西泮應(yīng)用劑量為4.5間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義柴胡加龍骨牡蠣湯聯(lián)合西藥治療組苯二氮卓類藥物的等效地西泮應(yīng)用劑量為27組苯二氮卓類藥物的等效地西泮應(yīng)用劑量為29之間無(wú)明顯差異。結(jié)論1.胡加龍骨牡蠣湯(5g品系小鼠上單次給藥3分鐘后均可產(chǎn)生穩(wěn)定的快速抗抑郁樣作用且作用持久天效果與氯胺酮相似2.胡加龍骨牡蠣湯全方及小柴胡湯均表現(xiàn)出快速抗抑郁樣作小柴胡湯是全方發(fā)揮快速抗抑郁作用的核心。桂枝茯苓大黃龍骨牡蠣部分雖沒(méi)有單獨(dú)表現(xiàn)出抗抑郁樣作但是可能對(duì)柴胡加龍骨牡蠣湯全方抗抑郁的持久性有重要意義3.球摘除抑郁模型小鼠具有很好的模型穩(wěn)定性。柴胡加龍骨牡蠣湯在嗅球摘除抑郁模型上表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗抑郁作而小柴胡湯沒(méi)有在該模型中表現(xiàn)出抗抑郁作用且可能有致焦慮樣行為反應(yīng)。4.球摘除模型小鼠前額葉谷氨酸受體AMPARAKT相關(guān)信號(hào)通路的抑制這可能是導(dǎo)致其抑郁表現(xiàn)的內(nèi)在機(jī)制柴胡加龍骨牡蠣湯能夠提高嗅球摘除模型小鼠前額葉AMPA值上調(diào)