核酸的分離純化核酸的分離純化1主要內容

前言1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結構的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分離提取核酸的主要步驟2.1細胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的濃度測定2.5核酸的保存主要內容前言2

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗。前言Home核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是31核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結構的完整性1.1.1意義：遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的—級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。1.1.2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定離子強度;

4）減少物理因素對核酸的機械剪切力.Home1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級結構的完整性41.2防止核酸的生物降解細胞內或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。1.2防止核酸的生物降解細胞內或外來的各種核酸酶能51.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；(2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質變性，并與變性蛋白結合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。1.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：61.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。1.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑R7(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。

作用機制：與蛋白質中His結合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環。但濃度比使蛋白質變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOO8（3)肝素（4）復合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home（3)肝素Home9(1)高速組織搗碎機搗碎(2)玻璃勻漿器勻漿(3)超聲波處理法(4)液氮研磨法(5)化學處理法(SDS、LDS，吐溫80等）(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）Home2.1細胞的破碎(1)高速組織搗碎機搗碎Home2.1細胞的破碎102.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質的結合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結合的蛋白質分開，同時避免核酸降解。2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除112.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質上游離出來的功能；

2.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）122.2.3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醇=25：24：1）。2.2.3酚/氯仿抽提13

(1）使用注意酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。(2）安全操作酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意Home(1）使用注意使用酚時應注意Home142.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質。2.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。152.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8

當核酸溶液的pH值大于4時，核酸分子呈多聚陰離子狀態，它與1價或2價陽離子形成的鹽在許多有機溶劑中不溶解，也不會被有機溶劑變性。2.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)162.3.2有機沉淀劑

（1）乙醇優點：

對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發除去，不影響以后實驗。缺點：

需要量大，一般要求低溫操作。2.3.2有機沉淀劑（1）乙醇17（2）異丙醇優點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數次。（2）異丙醇優點：18（3）聚乙二醇（PEG）優點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質量的DNA片段。應用6000相對分子質量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。（3）聚乙二醇（PEG）優點：19（4）精胺

精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結合后，使DNA在溶液中結構凝縮而發生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分開，達到純化DNA的目的。（4）精胺精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。202.3.3核酸沉淀的溫度和時間一般強調，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。Home2.3.3核酸沉淀的溫度和時間一般強調，核酸沉淀在低212.4核酸的濃度測定2.4.1紫外分光光度法測DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25μg/ml。

結論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。2.4核酸的濃度測定2.4.1紫外分光光度法測DN22紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉入分光光度計的石英比色杯中。b．分光光度計先用一定量的水校正零點。c．測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．計算濃度。

雙鏈DNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數×50/1000；RNA樣品濃度(μg/μl)=OD260×核酸稀釋倍數×40/1000。e．分析純度。紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟a．吸取一定量的DNA23A：測DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260m／OD230應大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2)小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。測定結果分析A：測DNA：測定結果分析24B：測RNA純的RNA樣品其OD260／OD280應介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質或酚的污染；2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。B：測RNA252.4.2溴乙錠熒光法測定核酸的含量

原理：DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發下，可發出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。

注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。Home2.4.2溴乙錠熒光法測定核酸的含量原理：DNA、RN262.5核酸的保存(1)對DNA

①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2)對RNA

①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;

②長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃,可保存數年。Home2.5核酸的保存(1)對DNAHome27基因組DNA的分離純化基因組DNA特點：線性DNA，長度長，在溶液中黏稠，沉淀后難溶解，易斷裂基因組DNA的分離純化基因組DNA特點：線性DNA，長度長，28基因組DNA的分離純化酚抽提法：以含EDTA，SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液裂解細胞，再經蛋白酶K處理，以pH8.0Tris飽和酚抽提DNA，再根據需要純化及濃縮。甲酰胺解聚法：細胞裂解步驟與酚抽提法一致，但以高濃度甲酰胺裂解液裂解DNA與蛋白質，再以透析除去雜質基因組DNA的分離純化酚抽提法：以含EDTA，SDS及無DN29基因組DNA的分離純化玻璃棒纏繞法：將基因組DNA沉淀纏繞于帶鉤玻璃棒上帶出，溶于pH8.0的TE其他方法：異丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法基因組DNA的分離純化玻璃棒纏繞法：將基因組DNA沉淀纏繞于30基因組DNA的分離純化DNA樣品的進一步純化：透析，沉淀，電泳，選擇性沉淀片段回收：原則：提高回收率，去除雜質污染從瓊脂糖凝膠中回收：DEAE纖維素膜插片電泳法，電泳洗脫法，冷凍擠壓法從聚丙烯酰胺凝膠中回收：壓碎與浸泡基因組DNA的分離純化DNA樣品的進一步純化：透析，沉淀，電31質粒DNA的提取和純化質粒的結構：超螺旋，半開環，線性DNA理化性質：與一般核酸相似，但抗切割和抗變性能力更強質粒DNA的提取和純化質粒的結構：超螺旋，半開環，線性DNA32質粒DNA的提取和純化方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質粒DNA釋放法；酸酚法等。堿裂解法有操作簡便、快速、得率高的優點。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理所有分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離質粒DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據實驗所需)選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素：質粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術和實驗要求。質粒DNA的提取和純化方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱33堿裂解法堿法提取主要是利用共價閉合環狀質粒與線性染色質在拓撲學上的差異來分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復中性時，線性染色體DNA不能準確復性，與其它大分子共沉淀，而質粒DNA卻可以準確復性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質粒的方法都用到質粒DNA分子相對較小和共價閉合環狀這兩個特性。由于操作原因提取的質?？捎腥N結構：超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）

堿裂解法堿法提取主要是利用共價閉合環狀質粒與線性染色質在拓撲34

堿裂解法流程圖對數期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌乙醇沉淀干燥溶解沉淀質粒DNA溶液堿裂解法流程圖對數期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液I35堿裂解法（一）儀器：恒溫培養箱、恒溫搖床、臺式離心機、高壓滅菌鍋（二）材料：含有質粒的大腸桿菌、LB液體培養基（三）試劑：溶液I50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA作用:分散細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II0.2MNaOH1%SDS（新鮮配制）作用:細胞壁肽聚糖堿性下水解,核酸和蛋白質變性。溶液III5MKAC：乙酸鉀：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85混合作用:酸性下質粒DNA復性，變性蛋白－SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA堿裂解法（一）儀器：恒溫培養箱、恒溫搖床、臺式離心機、高壓滅36堿裂解法平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白質變性并有助于液相與有機相的分離。平衡酚pH7.8（DNA分配于有機相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現的泡沫）注：用時取下層液，酚腐蝕性強，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA堿裂解法平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）37堿裂解法

1、取1.5ml培養液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。

2、棄上清,將管倒置于衛生紙上數分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴