馬立克氏病病毒meq基因序列分析

馬立克病（md）是馬立克病病毒（mdv）引起的一種雞腫瘤組織增生疾病。它的特點(diǎn)是雞的外周神經(jīng)、膜充血和內(nèi)臟器官形成腫瘤。1材料表面1.1檢測疾病的文件肝臟病料采自貴陽市某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的疑似MD矮腳黃雞，保存于貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(-80℃冰箱)。1.2質(zhì)粒提取和細(xì)胞系統(tǒng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒[購自天根生化科技(北京)有限公司]，HiFi-ScriptcDNA第一鏈合成試劑盒(購自康為世紀(jì)生物科技有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒、2×ESTaqDNAMix、pMD19-TVector、DL2000DNAMarker、DL5000DNAMarker[購自寶生物工程(大連)有限公司]，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。1.3凝膠成像儀和pcr檢測電泳槽(DYCZ-HOB型)、電泳儀電源(DYCZ-8C型)(購自北京市六一儀器廠)，SY-GENE電泳凝膠成像儀(購自GENE公司)，多功能梯度PCR儀(VeritiTm96-WellThermalCycler)(購自ABI公司)，37℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(BD53)(購自BINDER公司)。2方法2.1mdvmeq、引物、材料參考GXY2株meq基因(GenBank登錄號:EF546430)設(shè)計(jì)MDVmeq，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。2.2mdv核酸pcr檢測根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書分別提取總DNA和總RNA，再根據(jù)HiFi-ScriptcDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。使用MDVmeq特異引物對核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系20μL:上、下游引物(10mol/μL)各1.0μL,2×ESTaqDNA聚合酶10μL，核酸2μL,ddH2.3菌株轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)將MDVmeq的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～24h至長出菌落，挑取6個(gè)單菌落接種于含氨芐青霉素(50mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37℃170r/min培養(yǎng)12～16h。取培養(yǎng)的克隆菌液2μL進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)體系及條件同2.2)，提取陽性克隆菌液質(zhì)粒送華大基因測序。2.4遺傳進(jìn)化分析將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行比對，利用MegAlign軟件分析其同源性、氨基酸缺失位點(diǎn)，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。參考毒株信息見表2。3結(jié)果3.1mdvmeq基因檢測由圖1可見:經(jīng)PCR擴(kuò)增，于1020bp處出現(xiàn)MDVmeq基因特異擴(kuò)增條帶，長度與預(yù)擴(kuò)增片段相符，表明病雞存在MDV感染，將該片段命名為MDVGZ2019meq。3.2pcr確定了sdmeq基因克隆菌液的pcr結(jié)果由圖2可見:各克隆菌液在1020bp處均出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，與目的基因大小相符。3.3mdqldvgz19meq基因同源性分析測序結(jié)果顯示MDVGZ2019meq基因全長1020bp，共編碼339個(gè)氨基酸，將其與GenBank登錄的10株MDV參考株的meq基因進(jìn)行核苷酸序列、推導(dǎo)氨基酸序列同源性比對。由圖3可見:MDVGZ2019meq基因與參考毒株的核苷酸同源性為98.7%～99.8%。其與國內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的同源性最高(99.8%)，與國內(nèi)強(qiáng)毒MDV分離株J-1株、美國特超強(qiáng)毒MDV分離株648A株的同源性最低(98.7%)。由圖4可見:MDVGZ2019meq基因與參考毒株的推導(dǎo)氨基酸同源性為96.7%～99.4%。其與國內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的同源性最高(99.4%)，與荷蘭溫和型MDV分離株CVI988株的同源性最低(96.7%)。3.4q基因與mtk、n株、328a株的親緣關(guān)系由圖5可見:MDVGZ2019meq基因與國內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的親緣關(guān)系最近，與美國特超強(qiáng)毒MDV分離株TK株、N株、648A株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。3.5突變位點(diǎn)選取將MDVGZ2019meq基因推導(dǎo)氨基酸序列與GXY2等10株參考毒株進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)共有5個(gè)突變位點(diǎn)，分別為第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)(見圖6)。除第63位氨基酸突變是MDVGZ2019meq基因所獨(dú)有以外，其余突變位點(diǎn)與國內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株完全一致。4討論5mdvdgz19meq基因測序本試驗(yàn)從疑似MD貴州矮腳黃雞的肝臟病料中擴(kuò)增出MDVmeq基因，并進(jìn)行克隆及序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因長度為1020bp，可編碼339個(gè)氨基酸;與國內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的核苷酸序列同源性高達(dá)99.8%;存在5個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，除第63位突變是MDVGZ2019meq基因所獨(dú)有以外，其余突變位點(diǎn)均與國內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株完全一致，推測其為強(qiáng)毒株，具體致病性強(qiáng)弱還需進(jìn)一步研究。4.1meq基因是MDV-1中特有的主要