dmso誘導hl-60細胞分化為類中性粒細胞的研究

中立顆粒（pmns）是骨髓血漿形成的最終分裂細胞。它是血液中最常見的細胞，約占每周細胞總數的50%70%，在血液循環中的正常生命周期為24-48小時。成熟的中性粒細胞通過自發性凋亡(spontaneousapoptosis)這一機制來維持自身數量和內環境的穩定急性髓細胞性白血病細胞系(HL-60)為我們的研究帶來了新的思路。HL-60是人早幼粒細胞白血病細胞系(humanleukemia),它能在體外長期培養并具有相對的遺傳穩定性,如果用化學藥物對其進行誘導,HL-60細胞則可以表現出不同程度地向粒細胞、單核細胞分化的現象。例如,二甲基亞砜(dimethylsulphoxide,DMSO)可以誘導HL-60細胞沿粒系統方向成熟分化,這種經誘導分化而來的細胞形態比較特殊,多呈分葉狀,像中性粒細胞一樣具備吞噬能力,而且還具有很多中性粒細胞的分子標志物,如CB2受體、CD71、CD11b本文以此作為研究的重點,用DMSO誘導HL-60細胞,并運用光學顯微鏡觀察細胞形態、RT-PCR技術檢測類中性粒細胞標志物CD11b基因的表達,為確立類中性粒細胞可能成為中性粒細胞研究的替代模型提供理論依據。11.1培養基和試劑HL-60細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMSO購自Sigma;Trizol購自Invitrogen公司;DextranT-500購自Gibco公司;RPMI-1640培養基,胎牛血清購自HyClone公司;RT-PCR試劑盒購自Takara公司;引物均由Invitrogen公司合成。1.21.2.1谷氨酰胺co-bHL-60細胞購自中國科學院上海細胞庫。培養液為RPMI-1640(含10%FCS,10mmol/LHEPES,0.2mmol/L谷氨酰胺,25U/ml青霉素,25g/mL鏈霉素),于飽和濕度、5%CO1.2.2誘導hl-60的分裂調整細胞數為2×101.2.3rt-pcr檢測cd11b表達量CD11b和GAPDH引物序列分別為:CD11b-f:5’-GGCCTCAGAGAATACCAGT-3’;CD11b-r:5’-GGGTGAACACGGAATCGTT-3’。GAPDH-452-f:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’;GAPDH-452-r:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。總RNA的提取和CD11b表達量的檢測分別參照Trizol試劑盒說明書和RT-PCR試劑盒進行。即首先獲得cDNA,以cDNA為模板分別擴增CD11b及GAPDH內參片段,將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠定量軟件Quantity-one分析系統進行掃描定量分析。1.2.4實驗統計分析所有數據均經過SPSS17.0forwindows軟件進行統計分析。實驗的結果取自一次代表性實驗,且被3次獨立實驗證實。計量資料以22.1dmso誘導hl-60細胞的形態在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞。對照組HL-60細胞形態如圖1(a)所示;用DMSO誘導HL-60細胞48h后細胞形態如圖1(b)所示;用DMSO誘導HL-60細胞72h后細胞形態如圖1(c)所示。由圖1可見,各誘導時間段的HL-60細胞透明,立體感和遮光感效果佳,細胞活性好。隨著誘導時間的延長,被誘導細胞的體積逐漸增大,48h后出現了腎形核、分葉核、蠶豆核等粒細胞核型,并隨時間的延長逐漸增多;采用臺盼蘭拒染試驗及懷特-姬姆薩混合染色法鑒定各實驗組細胞狀態符合后續研究對細胞質量的要求。2.2結果圖1將提取獲得的RNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖2所示。可見到28S和18S亞基清晰顯示,28S與18S的帶寬比在1.8～2.0,說明RNA完整性良好,滿足后續實驗要求。2.3cd11b表達量的確定RT-PCR結果如圖3所示,同空白組相比,DMSO處理后24h開始,即有CD11b的表達上升,且隨著時間延長,CD11b的表達量也逐步升高(圖3(a));用Phoretix1D軟件讀取各條帶灰度值,誘導至48h后,誘導組CD11b的表達量較對照組由顯著差異(3類中性細胞的表達本研究用DMSO誘導HL-60細胞,采用光鏡下觀察細胞形態和利用RT-PCR技術分析分化標志物CD11b基因的表達,從而以確定HL-60細胞是否成功分化為類中性粒細胞,進而為利用類中性粒細胞為模型研究中性粒細胞自發性凋亡機制奠定基礎。外周血中性粒細胞為成熟的終末分化細胞,從骨髓進入外周血循環7～10h后進入組織、不再返回血液中,一般可存活1～2d,這是因為中性粒細胞一旦分化成熟便啟動其自發性程序凋亡,之后被巨噬細胞所吞噬,這是聚集在組織中的中性粒細胞消除的主要途徑。凋亡的中性粒細胞在形態上發生特征性改變,主要表現在:細胞膜皺縮,細胞體積減小;胞漿致密化,嗜酸性增加;分葉核間纖細的縮窄部消失,各分葉核固縮、濃集呈致密的球狀甚至融合,核染色質密度增高并凝聚在核膜周邊,核仁裂解;細胞膜發泡、內陷,凋亡小體形成。由DMSO誘導HL-60細胞沿粒系統方向成熟分化而來的細胞因其具備吞噬能力且細胞核的形態比較特殊,多呈分葉狀,其性質和形態均類似中性粒細胞,故稱之為類中性粒細胞。我們的實驗結果從2個方面證實了DMSO誘導HL-60分化的結論。首先我們在實驗中發現隨著誘導時間的延長,被誘導的細胞體積出現些許的增大。HL-60細胞是人類早幼粒白血病細胞,在血細胞的分化進程中接近于定向造血干細胞,細胞體積較成熟血細胞小,因此在DMSO誘導分化的過程中細胞體積會增大。其次,本實驗以CDllb作為HL-60分化表型標志,發現DMSO處理后24h開始,即有CD11b的表達上升,同空白對照組相比,兩者比較有明顯差異性,而且隨著時間延長,CD11b的表達量也逐步升高。CD11b作為HL60向中性粒細胞分化的標志基因,其表達量出現這種變化,即證明在DMSO