克氏綜合征患者新一代高通量測序植入前遺傳學診斷的臨床應用價值

47.0.2%，克里斯綜合征的發病率約為0.1%0.2%，主要表現為無精神癥、骨腫瘤、睪丸功能低下，少數患者表現為嚴重的精神障礙。1材料和方法1.1反復選擇篩查選取2016~2017年在本院生殖中心進行PGD助孕的5例克氏綜合征患者及其配偶作為克氏組,取同期因反復流產行植入前遺傳學篩查(preimplantationgeneticdiagnosisscreening,PGS)的20例患者資料進行對照,設為反復流產組。1.2實驗方法1.2.1gnrh-a/fsh/hgm長方案根據患者的年齡和卵巢儲備功能,采用本中心常規的GnRH-a/FSH/HMG長方案或GnRH-ant/FSH/HMG拮抗劑方案進行卵泡促排,當2個以上主導卵泡直徑大于18mm時給予HCG1×101.2.2ection培養系統所有患者均行卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)。采用G系列序貫培養系統(Vitrolife)進行胚胎培養。受精后5~6d,胚胎培養至囊胚階段,囊胚質量優于3BC的胚胎行囊胚活檢。利用激光法于囊胚內細胞團對側的滋養外胚層分離出3~8個細胞進行檢測。冷凍活檢后的囊胚,等待高通量測序結果。1.2.3基因擴增和庫構建法采用胚胎植入前遺傳學篩查文庫制備試劑盒(Pre-implantationGeneticsScreeningLibraryPrepKit,YikonGenomics,China),運用MALBAC-Lab(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles)技術,即基于多次退火環狀循環擴增技術的基因擴增和文庫構建法對活檢樣本進行全基因組擴增和文庫構建,建庫以后利用MiniSeq測序儀進行上機測序,并對測序的數據進行分析與解讀。高通量測序部分由億康基因公司負責技術支持。1.2.4單囊胚移植外引PGD/PGS結果正常的囊胚擇期進行復蘇與移植。患者采用人工周期進行內膜準備,囊胚復蘇按照加藤公司的玻璃化解凍試劑盒(KitazatoBioPharmaCo.Ltd,Japan)說明書進行,所有患者均為單囊胚移植。1.3術后護理移植后14d測血-HCG,陽性者2周后B超檢查發現宮內孕囊及胎心確定為臨床妊娠。孕16~20周行羊水穿刺檢查胎兒染色體。1.4統計分析采用SPSS16.0統計軟件系統進行數據分析。計量資料的組間均數比較采用t檢驗,組間率的比較采用χ2結果2.1臨床數據5例克氏綜合征中,4例核型為47,XXY,1例為嵌合體,核型為47,XXY2.2反復推流式引產階段20例克氏組患者共進行了5個ICSI周期,獲卵99枚,其中成熟MⅡ卵91枚;行ICSI后受精57枚,受精率為62.6%(57/91),卵裂率為100.0%;第3天(D3)繼續培養44個胚胎,形成17個可利用囊胚(可用于活檢的囊胚),可利用囊胚形成率為38.6%(17/44)。20例反復流產患者共進行了20個ICSI周期,共獲卵312枚,其中成熟MⅡ269個,行ICSI后受精207個,受精率為77.0%(207/269),第3天(D3)繼續培養203個胚胎,形成82個可利用囊胚,可利用囊胚形成率為40.4%。兩組患者的女方年齡、平均獲卵數、MⅡ率、卵裂率和可利用囊胚形成率間的差異均無統計學意義,但克氏組的受精率明顯低于反復流產組(P<0.05)(表1)。2.3反復流組的染色體異常情況克氏組患者行ICSI術后,1例嵌合體患者未獲得可利用囊胚,取消周期;其余4例患者共獲得17個囊胚,高通量測序結果顯示,12個囊胚未檢出異常(46,XN),其余5個囊胚為非整倍體,染色體非整倍體率為29.4%。檢測的17個囊胚中,未發現性染色體異常,5個異常的囊胚均為常染色體的非整倍體(表2)。反復流產組共檢測囊胚82個,其中50個未檢出異常(46,XN),32個為非整倍體,染色體非整倍體率為39.0%。克氏組的染色體非整倍體率低于反復流產組,但差異無統計學意義(29.4%vs.39.0%,P>0.05)。進行PGD檢測的4例克氏組患者均有可移植囊胚,并且都已行復蘇后單囊胚移植。其中,1例患者夫婦獲得3個正常囊胚,其配偶移植1個囊胚后順利妊娠,已分娩一健康女活嬰,染色體核型檢測為46,XX;1例患者送檢的2個囊胚中,1個正常,1個為15號單體(圖1),其配偶移植正常囊胚后妊娠,目前孕6月,羊水穿刺顯示胎兒核型為46,XN;1例目前配偶孕2月;另1例移植后未獲得妊娠。3克氏綜合征患者配子和胚胎中性染色體異常發生率的發生率47,XXY(克氏綜合征)在男性不孕人群中的發生率約為3.1%,主要表現為無精癥、睪丸功能低下