雙熒光素酶報告系統報告基因(reportergene):是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其表達產物非常容易被鑒定的基因。一般的，把報告基因的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控。在動物基因表達調控的研究中，報告基因被廣泛應用。如綠色熒光蛋白(GFP）和熒光素酶。一、概述熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化不同底物氧化發光的一類酶的統稱，哺乳細胞無內源性熒光素酶。熒光素酶報告基因的優點蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產生報告活性。在所有的化學發光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發光。檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。二、實驗原理

利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特性，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（fireflyluciferase）的上游，LUC啟動子細胞內目的基因的轉錄被激活未處理對照刺激物處理啟動子-Luc轉染細胞啟動子-Luc的啟動子被激活Luc的轉錄Luc表達量測得的熒光值同時，為了減少內在的變化因素（如：培養細胞的數目和活力的差別，細胞轉染和裂解的效率等）對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla

luciferase）的質粒（phRL-TK）作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，當加入熒光素酶檢測試劑II(LARII)時產生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo?試劑，將上述反應淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，同時進行第二次測量。A．檢測前相關試劑配制1.1XPLB裂解緩沖液配制：將4×體積水或PBS加入1×體積5XPLB裂解緩沖液。（使用前在室溫平衡1X緩沖液，平衡需2-3min）。2.LuciferaseAssayReagentII(LARII)配制：將LuciferaseAssayBufferII加入LuciferaseAssaySubstrate充分混合后，分裝，置于-20℃避光保存。（一次配好，分裝成小管，避免反復凍融），使用前將配好的LARII從-20℃拿出，并平衡至室溫（需20-30min）。三、操作程序與結果判定3.Stop&Glo?Reagent配制：現用現配，先將Stop&Glo?Buffer放在37度溫箱中平衡至室溫（15-30min），再將1倍體積的50XStop&Glo?Substrate加入49倍體積的將Stop&Glo?Buffer中。B．樣品制備1.仔細地將生長培養基從待檢細胞孔中吸出。用1XPBS漂洗細胞2-3次。此過程必須仔細，并盡量將漂洗用PBS吸盡（防止細胞掉落）。